一种促进河虾生长的生物制剂及其应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种促进河虾生长的生物制剂及其应用方法，属于生物制剂技术领域。
【背景技术】
[0002]肌抑素(Myostatin，MSTN),属于转化生长因子β (Transforming GrowthFactor-β, TGF-β )家族的新成员，主要表达于骨骼肌，抑制骨骼肌的生长，是骨骼肌生长发育的负调控因子。哺乳动物肌抑素基因突变及功能丧失均会导致骨骼肌的剧增，形成一种“双肌”现象。肌抑素N端前体肽是肌抑素C端活性肽的抑制剂，可通过结合并抑制肌抑素与其受体的结合，阻断肌抑素的信号转导通路，从而抑制其生物活性。肌抑素前体肽作为肌抑素的抑制剂，研究表明过表达肌抑素前体肽或将肌抑素前体肽注入小鼠均可以有效促进肌肉生长，表现出骨骼肌的“双肌”现象。在斑马鱼胚胎发育中过表达肌抑素前体肽，骨骼肌肌纤维数量显著增加，胚胎体型大、生长加快。因此，选择一种合适的表达载体表达肌抑素前体肽，通过饲料添加促进动物肌肉生长从而提高养殖动物的生产性能，在农业畜禽生产和水产养殖中具有巨大的应用前景。
[0003]河虾是我国最主要的淡水养殖虾类，近几年全国河虾养殖面积已达400万亩，年产量约20万吨，年产值近100亿元，河虾养殖已成为农业增效、农民增收的重要途径之一。但在河虾养殖中普遍存在生长缓慢、个体小型化等现象，导致河虾养殖产量低，市场价格居高不下。目前，主要通过河虾人工育苗、种质资源保护和改良途径，培育出经济性状好，抗逆性强的良种，通过河虾人工配合饲料的开发研制提高养殖河虾的规格和效益。
[0004]基于此，做出本申请。
【发明内容】
[0005]为了克服现有河虾养殖过程中所存在的生长缓慢、产量低等缺陷，本发明首先提供一种效果稳定、可快速促进河虾生长的生物制剂。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:
一种促进河虾生长的生物制剂，由如下重量含量的各组分构成:1-10%表达河虾肌抑素前体肽的重组枯草芽孢杆菌、5-50%壳聚糖和余量的玉米淀粉载体；所述的重组枯草芽孢杆菌采用如下方式获得:在河虾MSTN基因编码序列(GENBANK N0.KF530847)前体肽基因的5 ‘端和3’端插入BamH I和Hind III酶切位点，其引物序列如下:
MSTN-F (BamHl):
5 ^ ——GATCCACGCAGAAAAGCCACGGGAAAA——3，
MSTN -R (Hind3):
5 ^-----AAGCTTCCCTCGGCGACTTTCTTCCGT——3 ’
再通过PCR扩增反应，酶切获得基因片段，构建其重组表达质粒，该重组表达质粒连接转入枯草芽孢杆菌感受态细胞，诱导表达并培养后，筛选出表达量最高诱导菌株，将其接种于LB液体培养基中，培养过夜，收集后作为种子菌，该种子菌接种于发酵罐培养基中发酵培养，发酵后的菌液经冷冻干燥后即可。
[0007]进一步的，作为优选:
所述的重组枯草芽孢杆菌的菌含量为19个/克。
[0008]所述的诱导表达培养是指在28-30°C，180-200 rpm培养2_8h。
[0009]所述的菌株接种于LB液体培养基中，培养过夜是指添加氨苄青霉素50 Pg/ml、卡那霉素5 μg/ml、红霉素5μg/ml、林可霉素5μg/ml。于30-37°C培养过夜，至细胞密度为18 cfu/mlο
[0010]所述的种子菌接种量为1-5%。
[0011]所述的载体为玉米淀粉，其目数为80-200目。
[0012]同时，本发明还提供了一种上述促进河虾生长的生物制剂的应用方法，将该生物制剂按虾饵料总重的0.5-1%。加入河虾饵料中，生物制剂与河虾饵料一次混合混匀后，均匀喷洒5-10%。鱼油或花生油包被，二次均匀混合后即可喂食河虾。
[0013]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为工业酶制剂的生产系统已有多年历史，60%以上的商品酶制剂通过枯草芽孢杆菌表达生产。近年来，枯草菌逐渐用于药用蛋白、抗原蛋白的生产:其高分泌能力，使得重组表达的目标蛋白不需要经过下游的纯化和分离；枯草菌本身为益生菌，技术相对成熟且安全性高；由于芽孢的理化特性，口服制剂能够耐受胃肠道环境。本申请中，以河虾MSTN前体肽基因作为基础，向其结构中插入BamH I和Hind III酶切位点，并对其进行扩增、表达和培养，从而形成可以表达河虾肌抑素前体肽的重组枯草芽孢杆菌，再将该重组枯草芽孢杆菌与壳聚糖、载体进行混合形成生物制剂，该生物制剂混入常规饲料中，进而通过饲料添加途径达到促进动物生长。
[0014]本专利基于肌抑素前体肽抑制肌抑素生物活性的特点，采用枯草芽孢杆菌表达河虾肌抑素前体肽，作为饲料添加剂将肌抑素前体肽应用于河虾养殖，是一种快速有效促进河虾生长的途径。根据河虾MSTN基因编码序列(GENBANK N0.KF530847)前体肽基因设计引物，分别在5‘端和3’端插入BamH I和Hind III酶切位点，通过PCR扩增反应得到MSTN前体肽基因，将目的基因插入PMD19-T克隆质粒，用2种限制性核酸内切酶Hind III和BamH I进行酶切，获得951bp目的基因的片段，构建其重组表达质粒PET28A-P-MSTN，重组表达质粒连接转入枯草芽孢杆菌感受态细胞，进行IPTG诱导表达，在28-30°C，180-200 rpm培养2-8h0筛选出表达量最高诱导菌株。将分泌表达菌株接种于LB液体培养基中，添加氨苄青霉素50 Pg/ml、卡那霉素5 Kg/ml、红霉素5 μ g/ml、林可霉素5 μ g/ml。于30-37°C培养过夜，至细胞密度为10s cfu/ml，收集后作为种子菌。将种子菌以2.0%的接种量接种于发酵罐培养基中，于37°C、发酵培养2-3天。发酵后的菌液经冷冻干燥后即为MSTN前体肽工程菌粉。壳聚糖和玉米淀粉均能通过市购的方式获得；其中壳聚糖可选用饲料级壳聚糖，玉米淀粉能过80-200目筛。将前体肽工程菌粉按不同比例和市售壳聚糖、玉米淀粉搅拌混合，即制备成促河虾生长的口服生物制剂。
[0015]本发明的口服生物制剂具有以下优点:
I)使用方便，可作为饲料添加剂在河虾饲料中使用，本申请所制备的生物制剂以重组枯草芽孢杆菌、壳聚糖和载体为基本原料，形成可表达河虾肌抑素前体肽的独立生物制剂，因此，可直接将其按比例与河虾饲料混合、拌食。
[0016]2)安全性好、无副作用。本申请的三种主要原料中，重组枯草芽孢杆菌以河虾MSTN前体肽基因为处理对象，对其进行酶切、PCR表达、培养等处理，在处理过程中不引入任何有毒副作用的物质，因此安全性较好，不会对河虾造成毒害副作用。
[0017]3)促生长效果好，显著提高河虾生长速度。本申请所合成的生物试剂中，生物制剂由1~10%表达河虾肌抑素前体肽的重组枯草芽孢杆菌、5~50%壳聚糖和作为载体的玉米淀粉构成，其中表达河虾肌抑素前体肽的重组枯草芽孢杆菌的菌含量为19个/克，可充分有效促进肌肉生长，骨骼肌肌纤维数量显著增加，河虾体型大、生长加快。4)生产工艺简单