一种隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备方法与应用与流程

本发明属于海洋生物技术领域，尤其涉及一种隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备方法与应用。

背景技术：

自由基是指含有未配对的电子的原子、分子或基团，由于自由基中含有未成对电子，具有配对的倾向，状况不稳定，具有高度的活性。在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中。自由基产生过多或清除过慢，多余的自由基通过攻击生命大分子物质及各种细胞，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病，如自由基造成dna氧化损伤，细胞遗传信息转变，导致肿瘤的发生；自由基使脂质过氧化，导致动脉硬化等等。

抗氧化物的定义为“任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质”，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。人体在不可避免地产生自由基的同时，也在自然产生着抵抗自由基的抗氧化物质，以抵消自由基对人体细胞的氧化攻击。研究证明，人体的抗氧化系统是一个可与免疫系统相比拟的、具有完善和复杂的功能的系统，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。

通过筛选具有抗氧化特性的物质来辅助提高机体的抗氧化能力、延缓衰老的直接、有效、方便的重要方法之一。微藻作为一类具有重要研究利用价值的海藻，其抗氧化性一直是研究的热点之一。目前，已报道具有抗氧化活性的微藻主要有以下几种：螺旋藻、球等鞭金藻、蔷薇藻、紫球藻、扁藻和小球藻。

隐鞘鞘丝藻(lyngbyacryptovaginatus)，有时也叫隐鞘浮丝藻，植物单生，直或略弯曲，除不正常条件外，无坚硬的鞘；藻丝从中部到顶端渐渐变细，具有冒状结构，不能运动或不明显运动，宽3.5～10μm；细胞圆柱形，罕见方形，气囊充满细胞。经检索，现有技术中未见有关于隐鞘鞘丝藻相关应用的报道，特别是关于隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的抗氧化应用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备方法。本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物具有显著的抗氧化作用，可应用于制备具有抗氧化功能的保健食品和药品。

本发明的技术方案将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

一种隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备方法，包括如下步骤：

s1、取新鲜的隐鞘鞘丝藻湿藻，在温度为-20℃～-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3～5次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；上清液即为隐鞘鞘丝藻胞内液；

s2、向步骤s1所述的沉淀中加入体积分数为70％～99％的乙醇超声提取2～4次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，即得隐鞘鞘丝藻乙醇提取物。

优选地，步骤s2中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入乙醇进行超声提取。

优选地，步骤s2中超声提取的频率为35～40khz，温度为4℃。

优选地，步骤s2中每次超声提取的时间为10～30min。

本发明的另一目的是提供隐鞘鞘丝藻乙醇提取物在制备具有抗氧化功能的保健食品和药品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物可以显著提高秀丽隐杆线虫体内超氧化物歧化酶(sod)活力并促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)水平，具有显著的抗氧化作用。

(2)本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物可以延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，提高其存活率，具有显著的抗衰老和抗氧化作用。

(3)本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备方法具有周期短，有机溶剂消耗少，工艺简单，安全无毒，稳定高效等特点，适合工业化生产。

附图说明

图1隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图2隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

图3隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内sod活力的影响。

图4隐鞘鞘丝藻胞内液对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图5隐鞘鞘丝藻胞内液对秀丽隐杆线虫体内sod活力的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明所述隐鞘鞘丝藻(lyngbyacryptovaginatus)由中国科学院水生生物研究所提供，其在藻种库中的编号为fachb-890。

本发明所述一级水符合gb/t6682-2008中一级水的标准。

本发明人在对微藻进行研究的过程中，进行了大量的试验，意外发现隐鞘鞘丝藻胞内液和对提取隐鞘鞘丝藻胞内液后剩余的残渣进行乙醇超声提取制得到的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物均具有显著的抗氧化作用。而隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的抗氧化作用尤为显著。

在整体动物水平上以氧化应激模型及衰老相关模型进行试验，试验结果表明本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物能够显著延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，提高其存活率；同时，其能显著提高秀丽隐杆线虫体内的超氧化物歧化酶(sod)的活力和促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)的水平。本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物具有显著的抗氧化作用，试验过程未发现隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫具有毒性作用，说明本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物安全无毒，可应用于制备具有抗氧化功能的保健食品和药品。

本发明所述的抗氧化作用是指对以病理或生理条件下因发生氧化应激反应所产生的变化为主要特征的衰老及衰老相关疾病的防治作用。

本发明隐鞘鞘丝藻乙醇提取物可单独或与其他活性成分合用，作为唯一或主要活性成分应用于制备具有抗氧化功能的保健食品和药品，所述保健食品和药品的剂型优选为片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。

本发明实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。其中，sbasal溶液和smedium溶液的制备方法如下：

sbasal溶液：称取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1l，灭菌30min，冷却至40-50℃备用。

smedium溶液：取1l灭菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml胆固醇乙醇溶液，边加变振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m柠檬酸钾溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常温放置备用。

实施例1隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的隐鞘鞘丝藻湿藻，在温度为-30℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为85％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于隐鞘鞘丝藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示隐鞘鞘丝藻湿藻)，即得隐鞘鞘丝藻乙醇提取物。

此外，取步骤s1离心后分离得到的上清液，加一级水调节其相对于隐鞘鞘丝藻(湿藻)重量的浓度为2ga/ml(a表示隐鞘鞘丝藻湿藻)，即得隐鞘鞘丝藻胞内液。

实施例2隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的隐鞘鞘丝藻湿藻，在温度为-20℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融5次，在转速为10000r/min的条件下离心8min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为35khz，温度为4℃，每次超声的时间为30min，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于隐鞘鞘丝藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示隐鞘鞘丝藻湿藻)，即得隐鞘鞘丝藻乙醇提取物。

实施例3隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的隐鞘鞘丝藻湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3次，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为90％的乙醇超声提取4次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为15min，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于隐鞘鞘丝藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示隐鞘鞘丝藻湿藻)，即得隐鞘鞘丝藻乙醇提取物。

实施例4隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

取实施例1制得的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物，按终浓度300mga/ml加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)(由美国明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传信息保藏中心提供)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图1所示。

图1结果显示，隐鞘鞘丝藻乙醇提取物能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，提高其存活率。试验结果表明本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例5隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物，隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组隐鞘鞘丝藻乙醇提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针(购于sigma公司，cas号：2044-85-1)溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果用f检验分析，结果如图2所示。

图2结果显示，与对照组相比，经隐鞘鞘丝藻乙醇提取物饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物能够促进体内ros的清除，降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

实施例6隐鞘鞘丝藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内sod活力的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物，隐鞘鞘丝藻乙醇提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组隐鞘鞘丝藻乙醇提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养72h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，利用总sod活性检测试剂盒(购于碧云天生物技术研宄所，产品编号：s0101)测定秀丽隐杆线虫匀浆上清液中sod活力，结果如图3所示。

图3结果显示，与对照组相比，隐鞘鞘丝藻乙醇提取物能显著提高秀丽隐杆线虫体内sod的活力。试验结果表明本发明提供的隐鞘鞘丝藻乙醇提取物能够显著提高体内sod的活力，具有显著的抗氧化能力。

实施例7隐鞘鞘丝藻胞内液对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

取实施例1制得的隐鞘鞘丝藻胞内液，按终浓度300mga/ml加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图4所示。

图4结果显示，隐鞘鞘丝藻胞内液能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率。试验结果表明本发明提供的隐鞘鞘丝藻胞内液能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例8隐鞘鞘丝藻胞内液对秀丽隐杆线虫体内sod活力的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的隐鞘鞘丝藻胞内液，隐鞘鞘丝藻胞内液的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组隐鞘鞘丝藻胞内液等体积的smedium溶液，置于20℃培养72h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，利用总sod活性检测试剂盒(购于碧云天生物技术研宄所，产品编号：s0101)测定秀丽隐杆线虫匀浆上清液中sod活力。结果如图5所示。

图5结果显示，与对照组相比，隐鞘鞘丝藻胞内液能显著提高秀丽隐杆线虫体内sod的活力。试验结果表明本发明提供的隐鞘鞘丝藻胞内液能够显著提高体内sod的活力，具有显著的抗氧化能力。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。