一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物病害检测技术领域，具体设及一种能够及时观察小麦黑胚病症 状的接种鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 小麦黑胚病是指小麦巧粒表面有不同形状和程度的黑色、褐色等症状，该病不仅 降低小麦巧粒的外观品质，使小麦在市场上的出售级别降低而影响农民收入，而且降低种 子发芽率，影响面粉品质，给小麦生产带来严重的危害。
[0003] 小麦黑胚病病因复杂，受致病菌、环境因素及品种特性的影响，其严重程度随品 种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，各国报道的发病率一般在0.3~66.7%之间 变化（参见：l、Li Q Y, Qin Z, Jiang Y M,化en C C, Duan Z B, and Niu J S. Screening wheat genotypes for resistance to black point and the effects of diseased kernels on seed germination. J Plant Dis Protect, 2014, 121 (2): 79-88； 2、Fernandez, M. R., Sissons, M., Conner, R. L., Wang, H., amd Clarke, J. M. 2011. Influence of biotic and abiotic factors on dark discoloration of durum wheat kernels. Crop Sci. 51:1205-1214;3、代君丽，于巧丽，袁虹霞，邢小萍，张 猛，孙炳剑，李洪连.河南省小麦黑胚病菌的分离鉴定及致病性测定.植物病理学报， 2011, 41(3), 225-231.)〇
[0004] 小麦黑胚病是巧粒病害，在巧粒灌浆期发生发展，因为巧粒外有颖壳包被，不能及 时观察黑胚病的症状形成情况，如果去掉颖壳又会对巧粒生长造成严重伤害甚至造成巧粒 脱落，运给小麦黑胚病抗病机理研究、菌与寄主互作、病害防治等研究工作带来了一定的困 难。目前，针对小麦黑胚病接菌鉴定方法的报告，都是在小麦穗部直接喷洒接菌，进行或者 不进行保湿处理，成熟后统计发病率(参见：3、代君丽，于巧丽，袁虹霞等.植物病理学报， 2011，41(3)，225-231;4、康业斌，刘顺通，成玉梅，段爱菊.小麦对黑胚病的抗性及黑胚 对产量损失的影响，植物保护，1999,3:25-27)。因为颖壳的阻隔，运些鉴定方法都无法及时 的直接观察接菌后巧粒症状形成情况，而且由于没有直接将菌接在巧粒上，降低了致病菌 的侵染效果，从而影响实验的准确性。因此，非常有必要探索一种小麦黑胚病接菌鉴定的方 法，使致病菌直接侵染小麦巧粒、提高侵染效果确保实验结果稳定真实可靠，又能直接观察 黑胚病的症状形成情况。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是:针对直接喷洒接菌方法不能及时观察症状产生，W 及菌与巧粒由于颖壳阻隔导致鉴定结果准确性降低的不足，本发明提供一种能够及时观察 小麦黑胚病症状的接种鉴定方法。本发明首先在小麦抽穗后、巧粒未发育前将颖壳剪掉一 部分，待巧粒满仁后再喷洒接菌套袋保湿鉴定，不仅使喷洒的致病菌抱子可W直接与巧粒 接触，而且可W及时观察巧粒上黑胚病症状发生的情况，同时根据该浸染情况可W及时对 小麦作出合理的防治措施。由此，本发明首次提供了一种剪壳接菌鉴定小麦黑胚病的方法， 不仅可W及时观察症状的产生情况，而且使鉴定结果更稳定可靠;并且根据浸染情况可W 及时对小麦作出合理防治。
[0006] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为： 本发明提供一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，所述接种鉴定方法包 括W下步骤： a、 小麦穗部剪壳处理及杂菌隔离:在小麦抽穗后，用綴子将小麦穗上部及下部的小穗 各去掉3个，用剪刀将剩下小穗的颖壳从上面剪去1/2,并将麦芒剪掉，然后用硫酸纸袋将去 壳的小麦穗罩上W隔离杂菌； b、 小麦黑胚病致病菌的培养:将小麦黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中， 在25°C条件下暗培养12天； C、小麦黑胚病致病菌抱子悬浮液的制备:用蒸馈水冲洗步骤b培养得到的致病菌菌落， 然后经过滤、离屯、、调整抱子浓度后得到抱子悬浮液，于4°C冰箱保存备用； d、 喷洒接菌及套袋保湿:在小麦巧粒满仁时，将步骤C制备的抱子悬浮液摇匀后均匀喷 洒在步骤a中剪壳处理的穗子上，喷洒后用塑料袋将穗子罩上保湿5天； e、 小麦黑胚病症状观察:接菌后每天观察步骤d接种处理巧粒上病菌的侵染情况W及 巧粒黑胚病症状的形成； f、 鉴定结果记录:小麦成熟时收获惊干，将步骤d接种处理的穗子手工脱粒，统计黑胚 病巧粒占巧粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病鉴定的结果。
[0007] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤b中所述小麦黑 胚病致病菌为小麦根腐平厮蠕抱菌，狗牙根平厮蠕抱菌，幡摔草平厮蠕抱菌和草茎点霉菌 中的至少一种。
[0008] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤b中所述将小麦 黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中，具体操作过程为:首先将PDA培养基进行 灭菌，然后冷却至50~55°C时，在无菌条件下加入氨节青霉素钢，每IOOmL PDA培养基中氨 节青霉素钢用量为10化L，摇匀后倒平板;待培养基凝固冷却后，用手术刀片将小麦黑胚病 致病菌菌落切成3mm 2的小块儿，放于平板的中央，1块/皿。
[0009] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，PDA培养基进行灭菌 时的溫度为12rC，灭菌时间为20分钟;所述氨节青霉素钢的浓度为lOOmg/mL。
[0010] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤C中小麦黑胚病 致病菌抱子悬浮液的制备过程为： 首先用无菌蒸馈水(每皿中加入25mL无菌蒸馈水）冲洗步骤b中PDA平板上培养得到的 致病菌菌落，然后用纱布过滤至50 mL的离屯、管中，在4°C、4000 r/min的条件下离屯、5min， 去上清液;接着加入10 mL无菌蒸馈水摇匀再离屯、，去上清液;然后再加入5 mL无菌蒸馈水， 用血球计数板测定抱子浓度，根据测定的抱子浓度按比例加入无菌蒸馈水，调整至抱子浓 度为3 X IO5个/mL,得到小麦黑胚病致病菌抱子悬浮液。
[0011] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤d中所述小麦巧 粒满仁时，是指小麦巧粒发育为满仁，即小麦巧粒有1/3~1/4伸出未剪掉颖壳的时间。
[0012] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤e中接菌后每天 观察步骤d接种处理巧粒上病菌的侵染情况W及巧粒黑胚病症状的形成，根据浸染情况对 小麦作出及时防治。
[0013] 根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤e中所述观察采 用两种方法:一种是直接用肉眼观察;另一种是分时间段取样，制作切片用光学显微镜或扫 描或透射电镜观察，W明确黑胚病致病菌的侵染途径与小麦巧粒组织与菌互作时形态结构 的变化。
[0014] 本发明的积极有益效果： 1、本发明技术方案是在小麦抽穗后，从上部剪掉小穗颖壳的1/2，然后套硫酸纸袋隔离 杂菌，随着巧粒逐渐发育，当巧粒的1/3-1/4伸出颖壳时，进行致病菌抱子悬浮液喷洒接菌， 塑料袋保湿5天处理，接菌后可W每天观察巧粒上菌丝的定殖、生长W及黑胚病的产生情 况。本发明鉴定方法与直接在穗部喷洒抱子液鉴定相比，可W及时、直接的观察到巧粒的发 病情况，而且增强了鉴定的准确性。
[0015] 2、本发明技术方案中，首先将小麦穗部颖壳剪掉一部分，待巧粒伸出颖壳后再喷 洒接菌，既能保证小麦巧粒正常发育，又使黑胚病致病菌与巧粒直接接触，保证了鉴定结果 的准确性，而且巧粒有一部分漏在颖壳外，可W直接观察巧粒的发病情况;根据及时观察到 的浸染情况，可W对小麦作出及时合理的防治措施。
[0016] 3、小麦黑胚病是小麦生产区的常发病害，其病原复杂，严重程度还受环境影响。在 没有准确鉴定品种抗性的情况下，无法就小麦对不同病原的专化抗病性进行研究。本发明 所述接菌鉴定方法，首次采用剪掉部分颖壳、可W将抱子液直接喷洒在巧粒表面进行鉴定， 使致病菌与巧粒直接接触，充分保证了接菌效果，提高了鉴定的准确性与稳定性，从而保证 了筛选的抗病材料的真实可靠。
[0017] 4、本发明方法剪掉一部分颖壳，既保证巧粒可W正常发育成熟，又可W使发育中 的巧粒伸出颖壳外，避免了观察时颖壳阻隔的影响，可W直接观察接菌小麦巧粒上致病菌 抱子的生长情况与黑胚病的发生情况，为小麦抗黑胚病机理研究及菌与寄主植