南洋楹无性系组织培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种南洋楹无性系组织培养的方法。
【背景技术】
[0002] 南洋植(Paraserianthes falcataria)是含羞草科(Mimosaceae)，属常绿乔木树 种，种植后3~4年可成林，4~5年可利用，且根系具有结瘤固氮能力，可改良土壤、提高地 力，是一个生态友好型的优良速生工业用材树种。我国南洋楹栽培面积已达3万余公顷，但 现有栽培林分全部为实生苗造林，存在如下缺陷：（1)南洋楹种子主要依靠进口和在国内早 期引种尚存的少量散生母树上采集，种子来源不清、品质良莠不齐、产量年份波动较大；（2) 由于林木基因杂合程度高，南洋植林分普遍存在生长速度不一、分枝数量与大小不一等分 化问题。通过组织培养的方法可望快速满足市场对南洋楹良种种苗的需求，实现南洋楹造 林的无性系化和良种化，显著提高南洋楹林分的生长量和木材质量，促进南洋楹相关产业 可持续发展。
[0003] 目前，南洋楹组织培养技术尚处于试验研究阶段，主要由于外植体采集困难、灭菌 难度高、玻璃化及黄化现象严重、增殖倍数较低等瓶颈问题阻碍了其规模化繁殖。
【发明内容】
[0004] 基于此，本发明提供了一种南洋楹无性系组织培养的方法，该方法能够减少幼苗 玻璃化现象和无效愈伤组织的产生，有效提高增殖倍率以及成苗率，缩短培育周期，实现南 洋楹无性系规模化繁殖。
[0005] 具体技术方案如下：
[0006] -种南洋楹无性系组织培养的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)获取外植体:采集南洋楹优良母树种子，通过无菌育苗技术获得无菌苗，以单 株无菌苗作为外植体;或者采用南洋楹优良母树的根颈部位萌芽条作为外植体；
[0008] (2)诱导培养:将外植体分段切割，每段含1个顶芽或1~2个腋芽，接入诱导培养基 诱导愈伤组织及芽分化产生不定芽，培养1个周期后切除基部老化愈伤组织继续转接，再培 养一个周期，每个周期28~35天；
[0009] (3)增殖培养:将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，将步骤(2)的愈 伤组织和不定芽直接转入增殖培养基，自然散射光培养28~35天后，转接，转为人工光源培 养；
[0010] (4)生根培养:不定芽增长到3~5cm时，切下转入生根培养基，培养6~12天；
[0011] (5)炼苗:将培养瓶移到室外遮阴棚中闭瓶炼苗10~14天，边炼苗边生根，再揭去 瓶盖注入清水，注入清水的量为覆盖培养基平面以上0.5~1.0cm，开盖炼苗2~5天；
[0012] (6)植株移栽:将炼苗后的小苗根部的培养基清洗干净后，于晴天下午的4点半以 后或阴天移栽至育苗基质中，覆盖透明塑料薄膜，保湿，培育28~32天后除去塑料薄膜，让 其继续生长;所述育苗基质为体积比为3~4:1的黄心土和泥碳土。
[0013] 在其中一个实施例中，步骤(2)所述的诱导培养基由以下组分组成:MS培养基、0.4 ~1.0 mg/L细胞分裂素6-BA、25~35g/L鹿糖、6~8g/L卡拉胶;所述诱导培养基的p H为5.6 ~6;培养条件为:温度20~30°C，每天光照14~18小时，光照的强度为1000~20001x。
[0014] 在其中一个实施例中，步骤（2)所述的诱导培养基由以下组分组成:MS培养基、 0.5mg/L细胞分裂素6-BA、30g/L鹿糖、7g/L卡拉胶;所述诱导培养基的p H为5.8;培养条件 为:温度28°C，每天光照16小时，光照的强度为15001x。
[0015] 在其中一个实施例中，步骤(3)将不定芽团转入增殖培养基时将长度大于1.0cm的 芽体单独切下，并分段切割，每段含1个顶芽或1~2个腋芽。
[0016] 在其中一个实施例中，步骤(3)所述增殖培养基由以下组分组成:MS培养基、0.1~ 0 · 3mg/L细胞分裂素6-BA、0 · 01~0 · 05mg/L萘乙酸、25~35g/L鹿糖、6~8g/L卡拉胶;所述育 苗培养基的P H为5.6~6;培养温度为20~30°C，人工光源培养的光照强度为1000~ 2000 Ix，每天光照12~16小时。
[0017] 在其中一个实施例中，步骤（3)所述增殖培养基由以下组分组成：MS培养基、 0 · 2mg/L细胞分裂素6-BA、0 · 05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、7g/L卡拉胶;所述育苗培养基的p H 为5.8，培养温度为28°C，人工光源培养的光照强度为15001x，每天光照14小时。
[0018]在其中一个实施例中，步骤(4)所述生根培养基由以下组分组成：1/2MS培养基、 0 · 1~0 · 5mg/L萘乙酸、0 · 1~0 · 5mg/L吲噪丁酸、20~30g/L鹿糖、6~8g/L卡拉胶;所述生根 培养基的P H为5.6~6;培养温度为20~30°C。
[0019] 在其中一个实施例中，步骤(4)所述生根培养基由以下组分组成：1/2MS培养基、 0 · 2mg/L萘乙酸、0 · 2mg/L吲哚丁酸、25g/L蔗糖、7g//L卡拉胶;所述生根培养基的p H为5 · 8; 培养温度为28~30°C。
[0020] 在其中一个实施例中，步骤(5)所述闭瓶炼苗的时间为12天，注入清水的量为覆盖 培养基平面以上I cm，开盖炼苗的时间为3天。
[0021] 在其中一个实施例中，步骤(6)将炼苗后的小苗根部用浓度为5%的多菌灵清洗干 净;所述保湿为保持湿度80~90 %;除去塑料薄膜前，晴天需覆盖遮阴网；所述育苗基质为 体积比为3:1的黄心土和泥碳土。
[0022] 本发明的发明人经过长期的经验积累与实验研究，获得了本发明所述的南洋楹无 性系组织培养的方法，该方法经过发明人长期的实验研究，对诱导增殖流程、培养基以及培 养条件、炼苗等技术环节进行了优化。在诱导培养步骤中，在其培养基中加入高剂量细胞分 裂素6-BA可以快速诱导愈伤组织及芽分化，同时使芽体内积累一定浓度的激素，可降低后 续增殖培养过程中激素的使用量，减少幼苗玻璃化现象和无效愈伤组织的产生;增殖培养 过程中将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，有效提高了增殖倍率，使增殖倍 率提高到3.0以上;且在增殖培养时先将组培苗通过28~35天的自然散射光照，有效减少了 玻璃化和黄化现象，苗色增绿;将生根与炼苗结合进行，可缩短培育周期，强化炼苗过程，经 过本技术炼苗后的植株强壮、根长适宜、抗性增强，且苗木移栽的成活率显著提高;在植株 移栽步骤中选择在晴天下午4点半以后移植或者阴天移植，可以有效提高移植苗的成活率， 晴天下午4点半以后移植，其成活率达到早上的3倍。因此，本发明提供的南洋楹无性系组织 培养的方法可以有效减少幼苗玻璃化、黄化现象以及无效愈伤组织的产生，提高增殖倍率 以及成苗率，缩短培育周期，实现南洋楹无性系规模化繁殖。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
[0024] 实施例1南洋楹无性系组织培养的方法
[0025] 本实施例的南洋楹无性系组织培养的方法，包括以下步骤：
[0026] 1、获取外植体:在广东省博罗县林业科学研究所营建的引进南洋楹种源及家系试 验林中，采集17年的优良母树的BLS16种子，通过无菌育苗技术获得无菌外植体。
[0027] 2、诱导培养:选择1株生长健壮的无菌苗，苗高约3. Ocm，切除根部后，切分为2段， 其中一段含1个顶芽，另一段含2个腋芽，接入诱导培养基，培养35天后，切除基部老化愈伤 组织继续转接，再培养30天。诱导培养基的成分为:MS培养基+细胞分裂素6-BA(0.5mg/L) + 蔗糖(30g/L) +卡拉胶(7g/L)，p H值为5.8;培养条件为:温度28°C，每天光照16小时，光照的 强度为15001x。获得增殖芽12个，最长芽长度为5.0cm，幼嫩愈伤组织2团。
[0028] 3、增殖培养:将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，将愈伤组织和不 定芽直接转入增殖培养基，长度大于1.0 cm的芽体单独切下，并分段切割，每段含1个顶芽或 1~2个腋芽，接入增殖培养基。放置于培养室内可接收自然散射光的位置，控制温度约为28 °C。培养30天后，转接，培养光源转为光照强度为15001x的人工光源，每天光照14小时。增殖 培养基的成分为:MS培养基+6-BA(0.2mg/L)+萘乙酸(NAA，0.05mg/L)+蔗糖(30g/L)+卡拉胶 (7g/L)，pH值5.8。人工光源培养一个周期为20天，连续培养4个周期。每个周期得到的苗木 苗径粗壮，叶片多，叶色绿，平均苗高为3.2cm，平均增殖率为4.1。
[0029] 4、生根培养:不定芽增长到3~5cm时，切下转入生根培养基培养10天。生根培养基 成分为：1/2MS 培养基+NAA(0.2mg/L)+吲哚丁酸（IBA，0.2mg/L)+蔗糖(25g/L)+卡拉胶(7g/ L)，p H值5.8。培养温度约28°(3。
[0030] 5、炼苗:将培养瓶移到室外遮阴蓬中闭瓶炼苗12天，边炼苗边生根，再揭去瓶盖注 入清水(注水量为培养基平面以上lcm)，炼苗3天。所得植株强壮，抗风抗萎蔫性强，根系长 度2~4cm，适宜移栽。
[0031] 6、植株移栽：用浓度为5%的多菌灵清洗干净根部的培养基后，于晴天下午4点半 后移栽至育苗基质中，育苗基质为体积比为3:1的黄心土和泥碳