一种降低变异率的草莓茎尖脱毒组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及到一种降低变异率的草莓茎尖脱毒组织培养方法。
【背景技术】
[0002]草莓生产中病毒病危害严重，制约草莓生产的发展。脱毒种苗的培育和应用是解决这一问题的有效途径。由于各地对脱毒苗繁育采用的技术标准不统一，导致组织培养繁育的种苗脱毒率不高、未经病毒检测、种苗变异率增加、苗木质量混乱，已给草莓生产带来了危害和巨大的潜在风险。本发明主要解决的技术问题是:茎尖组织培养脱毒、组培变异率的控制、优质组培苗快速繁殖。
[0003]草莓因长期无性繁殖，在生产上受到多种病毒的侵染从而引起草莓植株发病称之为草莓病毒病。草莓植株中病毒的长期积累存在会使植株出现生长势减弱、个体矮化、叶片变小、心叶黄化、畸形果多、果实变小、产量下降、品质变劣等品种退化现象，严重时可引起毁灭性灾害，给草莓生产带来巨大损失。在草莓生产中造成严重危害的病毒主要有草莓皱缩病毒(SCV)、草莓斑驳病毒(SMoV)、草莓镶脉病毒(SVBV)和草莓轻型黄边病毒(SMYEV)等。对草莓病毒病的防治目前尚无有效化学药剂，生产中解决的办法之一是采用脱毒种苗进行无病毒栽培。目前草莓脱毒的主要方法是茎尖组织培养脱毒。
[0004]现有技术存在以下几个缺陷:
[0005]1、草莓基因型(品种)不同，所用的诱导培养基、增殖培养基、生根培养基激素配比不同，需要针对各个品种筛选不同的培养基配方，费时费力。
[0006]2、茎尖诱导培养基和增殖培养基选用不同的配方分别进行配制，程序繁琐，效率低。
[0007]3、增殖培养基激素种类和浓度配比选用不当。BA浓度偏高，最高达到3.0mg/L，导致产生大量芽丛，增殖系数过高，增殖苗弱小、细长，易于玻璃化，从而大大增加变异率，而且成苗率低;使用NAA(或2，4-D)等生长素，易于产生愈伤组织，从而增加变异率。
[0008]4、继代次数过多，甚至不加控制连续多年进行继代增殖，在组培逆境条件下长时间胁迫培养，导致组培苗变异的发生。
【发明内容】
[0009]针对现有技术存在上述的不足，本发明提供了一种降低变异率的草莓茎尖脱毒组织培养方法，适合草莓不同品种进行茎尖组织培养的通用培养基配方，无需针对不同品种筛选不同的培养基配方，以及增殖培养基配方降低了细胞分裂素(6-BA)的使用浓度，从而避免产生大量弱小芽丛以及细长、无效的组培苗，而且，采用交替增殖培养的方法，控制继代次数保持在8次，减少了变异的发生，而且易于进行标准化生产。
[0010]本发明的技术方案为，一种降低变异率的草莓茎尖脱毒组织培养方法，包括以下步骤:
[0011]制备草莓不同基因型的通用诱导培养基和增殖培养基；
[0012]基于上述诱导培养基将草莓茎尖进行初代培养并检测筛选出无病毒植株作为增殖母株；
[0013]将增殖母株进行增殖培养；
[0014]将经过增殖培养的增殖母株进行生根培养并进行驯化移栽。
[0015]上述的培养方法，其中，所述制备草莓不同基因型的通用诱导培养基和增殖培养基的步骤中，其中通用增殖培养基包括第一增殖培养基和第二增殖培养基，所述第一增殖培养基由以下成分组成:MS培养基、6-BA 0.5mg/L、IBA 0.lmg/L，所述第二增殖培养基由以下成分组成:MS培养基、6-BA 0.3?(h4mg/L、IBA 0.lmg/L0
[0016]上述的培养方法，其中，所述MS培养基中的NH4NO3添加量为原来的1/2。
[0017]上述的培养方法，其中，所述基于上述诱导培养基将草莓茎尖进行初代培养并检测筛选出无病毒植株作为增殖母株的步骤包括:
[0018]选择外植体；
[0019]剥取外植体的茎尖；
[0020]将外植体的茎尖进行初代培养；
[0021 ]通过病毒检测筛选出经过初代培养的植株作为增殖母株。
[0022]上述的培养方法，其中，所述选择外植体的步骤包括:在6?8月份晴天的中午，选择无病虫、品种纯正的健壮植株，切取带生长点的匍匐茎段2?3厘米，用流水冲洗干净;所述剥取外植体的茎尖的步骤包括:将表面清洗过的外植体置于超净工作台上，用70%乙醇表面消毒30秒，弃乙醇，加0.1%升汞消毒2分钟，并不断摇动，然后用无菌水冲洗5?8次，用无菌滤纸吸干水分，再置于解剖镜下用解剖刀切取0.2?0.3_的茎尖。
[0023]上述的培养方法，其中，所述将外植体的茎尖进行初代培养的步骤包括:将剥取的茎尖接种于茎尖诱导培养基中，诱导培养至茎尖萌发1.5?2.0cm，然后转至新鲜培养基中培养成苗。
[0024]上述的培养方法，其中，所述通过病毒检测筛选出经过初代培养的植株作为增殖母株的步骤包括:将经过培养成苗的植株取下部成熟叶片，提取总RNA或DNA，反转录后用特异性引物分别进行PCR扩增SCV、SMoV、SVBV和SMYEV的4种病毒的外壳蛋白基因，电泳检测有无扩增条带，筛选无病毒植株并作为增殖母株，淘汰带病毒植株。
[0025]上述的培养方法，其中，所述将增殖母株进行增殖培养的步骤包括:
[0026]步骤一:将增殖母株接种于第一增殖培养基上连续继代2次；
[0027]步骤二:将第一增殖培养基上连续继代2次的试管苗接种于第二增殖培养基上并连续继代2次；
[0028]将步骤一、步骤二交替继代增殖培养2个循环达到总继代次数为8代。
[0029]上述的培养方法，其中，所述将经过增殖培养的增殖母株进行生根培养并进行驯化移栽的步骤包括:
[0030]选2?3厘米的经过增殖培养的小苗转入生根培养基进行生根培养；
[0031]将生根的组培瓶苗在自然光下炼苗4?7天，然后移栽到种苗穴盘中，植株长到4?5片叶，株高4?5厘米，有10?12厘米长的根系6?7条，即可移出定植于网室。
[0032]上述的培养方法，其中，所述生根培养基由以下成分组成:1/2MS、0.lmg/L IBA，其中MS培养基中的NH4NO3添加量为原来的1/2。
[0033]本发明提供的一种降低变异率的草莓茎尖脱毒组织培养方法，包括以下步骤:制备草莓不同基因型的通用诱导培养基和增殖培养基;基于上述诱导培养基将草莓茎尖进行初代培养并检测筛选出无病毒植株作为增殖母株;将增殖母株进行增殖培养;将经过增殖培养的增殖母株进行生根培养并进行驯化移栽，通过本发明的方法确定了适合草莓不同品种进行茎尖组织培养的通用培养基配方，无需针对不同品种筛选不同的培养基配方，而且将诱导培养基和第一增殖培养基调整为同一配方，降低了技术难度，节省了时间，培养过程更加快速高效;增殖培养基配方降低了细胞分裂素(6-BA)的使用浓度，使增殖系数维持在3.0?5.0，从而避免产生大量弱小芽丛以及细长、无效的组培苗，同时，使用生长素IBA代替NAA、2，4-D等，使再生苗从幼苗茎部直接产生，避免产生愈伤组织进行再分化，控制了组培苗变异的发生。而且，采用交替增殖培养的方法，控制继代次数保持在8次，减少了变异的发生，而且易于进行标准化生产。
【具体实施方式】
[0034]在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
[0035]为了彻底理解本发明，将在下列的描述中提出详细的步骤以及详细的结构，以便阐释本发明的技术方案。本发明的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。
[0036]本发明提供了一种降低变异率的草莓茎尖脱毒组织培养方法，包括以下步骤:
[0037]步骤S1:制备草莓不同基因型的通用诱导培养基和增殖培养基，其中通用增殖培养基包括第一增殖培养基和第二增殖培养基，所述第一增殖培养基由以下成分组成:MS培养基、6-BA 0.5mg/L、IBA 0.lmg/L，所述第二增殖培养基由以下成分组成:MS培养基、6-BA
0.3?0.4mg/L、IBA 0.lmg/L，进一步，MS培养基中的NH4NO3添加量为原来的1/2，并将茎尖诱导培养基与第一增殖培养基统一为I种。
[0038]步骤S2:基于上述诱导培养基将草莓茎尖进行初代培养并检测筛选出无病毒植株作为增殖母株，具体包括:
[0039]步骤S2a:选择外植体，其中具体为在6?8月份晴天的中午，选择无病虫、品种纯正的健壮植株，切取带生长点的匍匐茎段2?3厘米，用流水冲洗干净。
[0040]步骤S2b:剥取外植体的茎尖，具体为将表面清洗过的外植体置于超净工作台上，用70%乙醇表面消毒30秒，弃乙醇，加0.1%升汞消毒2分钟，并不断摇动，然后用无菌水