一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞低溫冻存技术领域，具体是一种利用微通道低溫冻存大鼠膜岛细 胞的方法，该方法是将含有氨基酸类凝胶因子的大鼠膜岛细胞悬浮液导入微通道中，使其 在微通道受限空间中自组装形成具有纤维状Ξ维网络结构的超分子凝胶，进而在低溫冻存 过程中保护大鼠膜岛细胞，减小细胞冷存损伤。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是常见的内分泌疾病，据国际糖尿病联盟公布数据显示，全球糖尿病患者 目前已达3.82亿人，而我国糖尿病患病人数居全球之首，占全球患者总数的Ξ分之一。细胞 移植是治疗糖尿病的有效手段。但是由于每一次分离得到的活体细胞数量很难满足一次临 床移植的需要，因此膜岛细胞的保存是膜岛移植需要研究的重要课题。
[0003] 低溫冻存是目前保存细胞或组织最普遍的方法，即往含有活细胞或组织的培养液 中加入一定量的冻存保护剂，然后W-定的速率降至某一溫度，并将活细胞或组织保存在 该溫度下一定时间。在冻存过程中，细胞内的新陈代谢被抑制，细胞或组织的活性"暂停"， 所W细胞或组织得W长期保存，待需要使用时再将其复溫，细胞或组织的活性和功能可恢 复正常D关于膜岛的冷冻保存国内外已有相关的文献报道(如:文献[1]化rlos A.Agudelo, Hiroo Iwata. The development of alternative vitrification solutions for microencapsulated islets[J]. Biomaterials，2008，29:1167-1176 ;文南犬[2]Stephan Schneider ,KaraId H.Klein. Long-term graft function of cryostored alginate encapsulated rat islets[J].Eur J Med Res，2011，16:396-400.;文献[3]Liu F.，Tian W.C.，Yang Y.A.，Zhang Q.，Zhu M.M.，Yang L.，Yang L.，Li J.，Liu J.，Wu P..Optimal method for short-term or long-term islet preservation: comparison of islet culture,cold preservation and cryopreservation[J].Journal of Artificial Organs，2014，17(4): 337-343.)，目前的方法主要有玻璃化冷冻保存和慢速冷冻保存两种。 在化温冻存过程中，细胞内外形成的冰晶会对大赢膜岛细胞造成损伤，而且在冻存保护剂 添加过程细胞内外渗透压的变化也会对细胞造成伤害。虽然这两种方法能在一定程度上降 化细胞受到的冰晶损伤，但是在冻存过程中细胞直接或间接地暴露在冻存保护剂中，所W 细胞毒性较大，细胞的存活率和功能受到了一定的影响。
[0004] 由软刻蚀法制得的微通道装置由于具有成本化廉、形状可塑W及生物相容性好等 优点而在生物材料等领域的应用越来越广泛（如：文献[4]Chandran R.B.，Reinhart J.， Lemke E.,Hubei A.. Influence of buoyancy-driven flow on mass transfer in a two-stream microfluidic channel: Introduction of cryoprotective agents into cell suspensions[J].Biomicrofluidics,2012,6(4):221-228;文南犬[5]Tseng H.Y.，Sun S., Shu Z.，Ding W.，民eems J.A.，Gao D..Amicrofluidic study of megakary Cytes membrane transport properties to water and dimethyl sulfoxide at suprazero and subzero temperatures[J].Biopreservation&Biobanking,2011,9(4):355-362)〇 Utkan Demirci等在微通道中，利用微流控技术精密控制了冻存保护剂的用量和流速，使冻 存保护剂缓慢地渗入到细胞中，从而减少了冻存保护剂的用量，降低了低溫冻存体系的毒 性，提高了细胞存活率（见文献[6]Young S.Song,Sang化η Moon,Leon Hulli,Syed Κ.Hasan,Emre Kayaalp,Utkan Demirci.Microfluidics for cryopreservation[J].Lab 化ip. 2009,9(13) :1874-1881.)。微流控技术不仅可W控制微通道中流体的流量、形状、体 积和成份，而且提供尺寸可控的受限空间。由PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基娃氧 烧的英文缩写）制作的微通道因其透光性好，故通常与显微镜技术相结合用来实时观测和 记录尺度在微米或纳米级物质的形貌。
[0005] 超分子凝胶是一类由低分子量的凝胶因子聚集而形成的软物质，它是低分子量凝 胶因子在一定环境条件下自组装形成的超分子化合物。凝胶因子自组装形成超分子凝胶的 驱动力包括氨键、η-π堆积、亲疏水相互作用、静电相互作用等非共价相互作用。当外界刺激 (如pH变化、环境溫度、磁信号)发生变化时，超分子凝胶能够快速且自发地对外界刺激做出 响应，由于运些非共价相互作用具有可逆性，所W超分子凝胶对外界刺激的响应变化通常 都是可逆的。而且，生物体中的凝胶体系多由弱相互作用构成，所W与聚合物凝胶相比，超 分子凝胶的结构更接近于生物体，具有更好的生物相容性，因而被广泛用于生物医用材料、 生物传感器等领域。由文献[7]Vineetha Jayawa;rna,Mu;rtza Ali,Thomas A.Jowitt,Aline F.Miller,Alberto Saiani,Julie E.Gough,Rein V.U1ijn.Nanostructured hydrogels for three-dimensional cell culture through self-assembly of fluorenylmethoxycarbony 1-dipeptides [J] .Adv .Mater. 2006,18:611-614,文献[8] Hongzhou Huang,Ying Ding,Xiuzhi S.Sun,Thu A.Nguyen.Peptide hydrogelation and cell encapsulation for 3D culture of MCF-7breast cancer cells[J].Plos One, 2013,8(3),|659482.和文献[9化011日]14.化16,1?日化14日？.化旨日'4日1',4736旨111411：11]16日3, Hassna R.Ramay,Monica C.Branco,Joel P.Schneider,Darrin J.P°Chan.Properties and bioproperties in self-assembledP-hairpin peptide hydrogels[J].Faraday Discuss.，2008，139:251-264可知，最近，基于低分子量的凝胶因子形成的超分子凝胶鲜见 冷冻体系的报道。
[0006] 本发明基于低分子量的氨基酸类凝胶因子利用其在微通道受限空间中自组装形 成的超分子凝胶包埋大鼠膜岛细胞，然后进行低溫冻存，而关于该方面的文献还未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明所需要解决的技术问题是:提供一种利用微通道低溫冻存大鼠膜岛细胞的 方法。利用成本低廉、简单可行的方法制备微通道装置，在微通道内构建一种生物相容性好 的超分子凝胶冻存体系，该体系能减小被包埋的大鼠膜岛细胞在冻存过程中受到的损伤， 提高其复苏后的存活率并维持细胞功能，从而起到有效的冷冻保护作用。
[0008] 本发明解决其技术问题采用W下的方案：
[0009] 本发明提供的利用微通道低溫冻存大鼠膜岛细胞的方法是利用微通道的受限空 间使超分子凝胶的Ξ维结构发生改变，W更好地保护大鼠膜岛细胞，具体是:将低分子量的 凝胶因子溶于细胞培养基中，待其溶解后制备得到含有一定量凝胶因子的大鼠膜岛细胞悬 浮液;然后将此大鼠膜岛细胞悬浮液导入微通道中，并置于3~5°C冰水浴中使其发生凝胶 化，随后再将第一冻存保护剂或第二冻存保护剂导入微通道中，使第一冻存保护剂或第二 冻存保护剂缓慢渗透到细胞中，并将微通道装置置于程序降溫盒中放入-75~-85°C冰箱中 冻存。
[0010] 所述的微通道装置由微通道和载玻片组成，微通道管道宽为200~280μπι，深度为 115 ~22 如m。
[0011] 所述的微通道装置由软刻蚀法制备得到，具体是:将聚二甲基硅氧烷前聚体与固 化剂按质量比例10