一种利用ghrelin促进新生雏鸡小肠发育的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及减少新生维鸡小肠发育的方法具体设及一种利用曲relin促进新生 维鸡小肠发育的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 在鸡胚解化的过程中，卵黄囊是其主要的能源库，然而，小鸡一出壳，就面临着由 W脂肪为主的液体食物向W碳水化合物和蛋白质为主的固体食物转变的巨大挑战，为了适 应运一挑战，小鸡的胃肠道就必须尽快完成结构和功能上的转变。而小肠黏膜机械屏障的 结构完整性，是营养物质消化与吸收的基础，特别是小肠绒毛高度、黏膜厚度W及绒毛高度 与隐窝深度的比值（V/C)是衡量小肠消化吸收功能的重要指标，各种消化酶的活性产生是 营养物质消化和吸收的前提。然而目前对于提高维鸡出壳时小肠发育的方法还很少见。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种利用曲relin促进新生维鸡小肠发 育的方法及应用。
[0004] 本发明的技术方案是：一种利用曲relin减少新生维鸡小肠发育的方法，具体是 通过在受精蛋开始解化的第五天至第十五天之间向卵白内注射至少一次曲relin溶液。
[0005] 本发明的进一步改进包括：
[0006] 所述曲relin溶液的浓度为100-15化g/ul，每次每蛋注射量为0. 1ml。
[0007] 在受精蛋开始解化的第五天和第十五天时，分别向卵白内注射一次曲relin溶 液。
[0008] 在受精蛋开始解化的第五天时，每枚蛋注射浓度为l(K)ng/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0009] 在受精蛋开始解化的第五天时，每枚蛋注射浓度为15化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0010] 在受精蛋开始解化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为10化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0011] 在受精蛋开始解化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为15化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0012] 本发明的另一目的在于，曲relin在促进新生维鸡小肠发育中的应用。
[0013] 本发明实施方法简单，通过卵内饲喂，能显著提高鸡胚出壳时十二指肠、空肠、回 肠的绒毛高度和肌层厚度，提高消化酶SI和化ptlmRNA的转录表达。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例对本发明做详细说明。
[0015] 实验材料与方法
[001引 1试验材料
[0017] 1. 1实验动物
[0018] 选用Ross肉鸡受精种蛋（新乡大用有限公司）称重，挑取重量在65-70g的蛋140 枚，随机分成7组，每组20枚，分别为Control组（正常解化倍，不做任何处理）、E5-100组、 E5-150组、E5-醋酸组、E15-100组、E15-150组、E15-醋酸组。对各组蛋进行编号，记录。 解化条件：37. 5 ± 0. 2 °C，相对湿度55 ± 2 %。
[0019] 1. 2动物处理：卵内喂食曲relin
[0020] Control组在整个解化的过程中不做任何处理；
[0021]E5-100组在E5胚龄时每枚蛋注射浓度为10化g/ul的曲relin溶液0. 1ml;
[0022] E5-150组在E5胚龄时每枚蛋注射浓度为150ng/ul的曲relin溶液0. 1ml，
[0023] E5-醋酸组在E5胚龄时每枚蛋注射醋酸0. 1ml ;
[0024]E15-100组在E15胚龄时每枚蛋注射浓度为lOOng/ul曲relin溶液0. 1ml，
[00巧]E15-150组在E15胚龄时每枚蛋注射浓度为15化g/ul曲relin溶液0. 1ml。
[0026]El5-醋酸组在E5胚龄时每枚蛋注射醋酸0. 1ml;
[0027] 曲relin溶液的配方：鼠曲relin粉末，用浓度为0. 1%醋酸稀释。
[0028] 卵内喂食的具体步骤：E5(开始解化的第五天）胚龄时，通过照蛋器照蛋发现卵白 的位置在气室的正下方，E15胚龄时，通过照蛋器照蛋，发现卵白的位置在气室的斜下方，标 出注射位点。采用22G针头卵白注射曲relin溶液，注射后，玻璃纸蜡封注射口，继续解化， 此时，解化器摇蛋按钮关闭，24小时后，蜡封的口凝固后，重新打开摇蛋按钮，继续解化。
[0029] 1.3组织取材
[0030] 维鸡出壳后新生维鸡称重，记录。按100mg/lOOg体质量乌拉坦麻醉，然后颈椎脱 白处死，其中每组17只鸡取十二指肠、空肠、回肠用0. 75%的生理盐水冲洗干净，用滤纸吸 去多余的水分，再用万分之一的分析天平称重后置于4%的多聚甲醒憐酸缓冲液（PH7. 4) 中固定。另外Ξ只取十二指肠、空肠、回肠液氮冷冻后，置于-80°C冰箱中保存备用
[0031] 2试验方法
[0032] 2. 1石蜡切片制作
[0033] 将固定好的脾脏、法氏囊等组织置于水龙头下，流水冲洗24小时后置于梯度酒 精脱水（50 %酒精化、60 %酒精化、70 %酒精化、80 %酒精化、90 %酒精比、100 %酒精 I30min、100%酒精II30min)，再放入二甲苯：无水酒精（1:1)I、11各比，最后置于二甲 苯中透明。透明后的组织顺次放入蜡I、蜡II各30min，最后放入蜡III比，包埋组织，制作蜡 块。将组织蜡块切片机连续切片，厚度5μm，45 °C水浴展片，拱片，55 °C烤片机烤片，后置于 37°C电热恒溫干燥箱内24h备用。
[0034] 2. 2常规肥染色
[003引（1)将脱蜡处理后的组织切片用蒸馈水洗涂干净；似苏木精溶液染色约lOmin; (3)用蒸馈水冲洗去多余的染液，0.5%盐酸乙醇溶液中l-3s(至镜检下细胞浆为无色时取 出）；(4)蒸馈水洗涂3次，每次约5111^，后自来水蓝化20111山；（5)依次浸入50%乙醇溶液、 70%乙醇溶液、85 %乙醇溶液，每级l-2min;(6) 0. 5 %伊红乙醇溶液染色约2min;(7)依次 浸入95%乙醇、无水乙醇中脱水（每级l-3min) ;(8)二甲苯：无水乙醇（l:l)3min;(9)二 甲苯透明处理lOmin，最后用中性树胶封片，封好后置于通风柜中惊干。
[0036] 2. 3PCNA(细胞增核抗原）免疫组化
[0037]1.石蜡切片经二甲苯I、二甲苯II各脱蜡5min，浓度递减梯度酒精3min，最后置 蒸馈水中。
[003引2.于0.01M的巧樣酸钢酸碱缓冲液中，微波修复（要求：调整火力使缓冲液溫度 保持在92-95°C，时间持续15min，冷却至室溫），暴露抗原。
[0039] 3. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0040] 4. 3%双氧水（用甲醇和30%双氧水配制）处理，置于湿盒室溫避光解育30min， 封闭内源性的过氧化物酶。
[0041] 5. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[004引 6. 5%的山羊血清（用0. 01PBS配制）处理，置于湿盒室溫解育30min，进一步抑 制假阳性表达。
[0043]7.不清洗，甩去多余液体，加PCNA单抗（小鼠抗人，用0. 01MPBS1:200倍稀释）， 每张片上选择1-2片组织作为阴性对照，阴性对照加等量的0. 01MPBS，4°C解育过夜。
[0044] 8.室溫恒溫比。
[0045] 9. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[004引 10.加二抗（山羊抗小鼠IgG，用0. 01MPBS1:100倍稀释），置于湿盒室溫解育化。
[0047] 11. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0048] 12.利用DAB显色试剂盒显色：1血蒸馈水中，加入A试剂一滴，混匀，再依次加 入B、C各一滴，混匀。滴加至切片上，置于湿盒室溫避光解育，显微镜下观察，控制显色时 间（注意：在保证充分解育的同时，又要防止背景颜色过深），显色完成后，用蒸馈水漂洗干 净。
[0049] 13.苏木素复染