一种提高对叶百部组培苗生根率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物组织培养技术领域，具体而言，设及一种提高对叶百部组培苗生 根率的方法。
【背景技术】
[0002] 对叶百部（StemonatuberosaLour.)主产于广西、湖南、贵州等省，为《中华人民 共和国药典》(2005、2010年版）所收载。具有归肺经，性微溫，味甘、苦，具有润肺下气止咳、 杀虫灭風等效果，用于新久咳嗽、肺瘦咳嗽和百日咳；外用于头風、体風、晓虫病和阴痒等。 国内已有140家制药企业将其制成颗粒剂、片剂、膏剂、糖浆剂销往全国内服、外用，多个产 品已成为国内外知名品牌，生产企业也成为当地的经济支柱之一。
[0003] 百部是中国传统成方制剂的常用药材，每年还大量出口到港、澳、台、韩国、日本。 有二十多个企业进行百部生物总碱的提取，制作洗发水、沐浴液等日用化工产品，制作杀 虫、灭菌生物农药。市场调查显示，全国医药、农药、日化、出口等行业每年使用百部药材达 3000吨，并呈逐年增加之势。
[0004] 目前，对叶百部药材完全依靠采挖野生资源，而对叶百部在野生状态下结实性差， 自然繁殖能力弱，生长缓慢，=年W上才能形成产量，需求明显大于产出，造成其药材经常 缺货断档。业内人±研究用组织培养解决种苗繁育问题，但在生根环节一直没有取得突破。 因此，提高植物组织培养过程中对叶百部的生根率，开展人工种植迫在眉睫。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明针对目前对叶百部人工栽培用苗紧缺的问题，建立对叶百部组培快速繁殖 体系，尤其是解决对叶百部组培苗生根难、生根率低的问题，为对叶百部的快速繁殖提供技 术保证，适合于规模化生产。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[0008] 一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括W下步骤：
[0009] (a)、选择百部顶芽作为外植体，对所述外植体进行无菌处理；
[0010] 化）、将无菌处理后的外植体切取茎尖，得到的茎尖转入诱导培养基培养28-35d， 得到无菌苗；
[0011](C)、将所述无菌苗切割为1. 0~1. 5cm的带芽茎段，接种于增殖培养基，诱导丛生 芽，培养时间为18-25山得到无菌芽； 阳01引 （d)、将所述无菌芽切成带芽茎段，接种于生根培养基，所述生根培养基为：1/2浓 度的改良MS培养基中含有NAA1. 5~2. 5mg/l、IBA0. 5~3. 〇111邑/1、氯化胆碱0~1. 5g/ L薦糖30~40g/l、琼脂5~7. 4g/L;
[0013] (e)、所述生根培养基中的带芽茎段长出新芽、新根，即得到生根苗，将所述生根苗 于常溫下遮阴处炼苗处理，然后移栽到草炭或黄屯、±基质中；
[0014] 所述改良MS培养基是将MS培养基中的畑4NO3改为800 +lOmg/L、KH2P04改为 340 ±lOmg/l，无水化Clz改为330 ± 2mg/L，其余成分含量不变。
[0015] 本发明提供的一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，W茎尖作为诱导材料，能 减少种苗带病毒的几率；在增殖阶段诱导丛生芽，提高了增殖倍数；生根培养基中选择性 添加NAA、IBA、氯化胆碱，提高对叶百部组培苗的生根率，生根率可达95 %;生根苗经过炼苗 后移栽到草炭或黄屯、上基质中移栽，提高成活率，成活率可达99 %，并且整个过程提高对叶 百部组培苗生根率稳定性好，有效解决了对叶百部组培苗难于生根和生根率低的难题，降 低了生产成本，为实现规模化生产和种质资源的保护提供了条件。
[0016] 本发明对MS培养基进行了改良，MS培养基W及改良MS培养基具体成分含量如表 1所示。
[0017] 表1MS培养基W及改良MS培养基具体成分
[0020] 为了进一步减少种苗带病毒的几率，优选地，在步骤（a)中，选择无病害、健壮的 百部顶芽作为外植体，W易于后续培养。
[0021] 优选地，在步骤（a)中，所述无菌处理为：
[0022] 将所述外植体用无菌水冲洗后，放在超净工作台上，用70% -75%的酒精浸泡 30~40s，再用0. 1 %~0. 2%的升隶溶液处理6~14min，无菌水清洗4~6次。
[0023] 经过该无菌处理后得到的外植体无菌，利于后续的培养。
[0024] 优选地，在步骤化）中，所述茎尖的长度为0. 15-0. 30mm。m亥长度的茎尖进行培 养，易于诱导丛生芽，诱导培养过程中，茎尖接种于诱导培养基表面。
[00巧]为了提高诱导的效果，优选地，在步骤化）中，所述诱导培养基的成分为： 阳〇%] 改良MS培养基中含有NAA0. 2~0. 5mg/l、BA0~1.Omg/l、薦糖30~40邑/1、琼 脂 5 ~7. 4g/L。
[0027] 更优选地，在步骤化）中，所述诱导培养基的成分为：
[0028] 改良MS培养基中含有NAA0. 4 ~0. 5mg/l、BA0. 9 ~1.Omg/l、薦糖 30 ~32g/L、 琼脂5~5. 5g/L。
[0029] 为了达到更好的增殖效果，优选地，在步骤（C)中，所述增殖培养基成分为：改良 MS培养基中含有 6-BA1. 0 ~2.Omg/l、KT0 ~1.Omg/l、NAA0 ~1. 2mg/l、薦糖 30 ~40g/ L琼脂 5. 0 ~7. 4g/L。
[0030] 更优选地，在步骤（C)中，所述增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 1. 8 ~2.Omg/l、KT0. 8 ~1.Omg/l、NAA0. 2 ~0. 3mg/l、薦糖 38 ~40g/l、琼脂 5. 5 ~ 6.Og/Lo
[003U生根培养基中选择性添加NM、IBA、氯化胆碱，W提高对叶百部组培苗的生根率。 优选地，在步骤（d)中，所述生根培养基为：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA2. 3~ 2. 5mg/L、IBA1. 0 ~1. 2111邑/1、氯化胆碱 0. 9 ~1.Og/L、薦糖 38 ~40g/l、琼脂 5. 0 ~5. 5g/ L。
[0032] 为了进一步提高生根率，优选地，在步骤（d)中，所述生根培养基前期在IOOlx弱 光下培养5~7山再进行光照培养。
[0033] 为了给组培苗的生长提供更适宜的生长条件，优选地，步骤化）~（d)中的培养基 的抑值均为5. 8~6.0,培养溫度为23°C~27°C，光照时间为10~14小时/天，光照强度 为1400-20001X。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0035] (1)本发明提供的一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，W茎尖作为诱导材料， 能减少种苗带病毒的几率；在增殖阶段诱导丛生芽，提高了增殖倍数，增殖倍数在4. 5倍W 上。
[0036] (2)本发明提供的一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，生根培养基中添加 NAA、IBA、氯化胆碱，生根培养前期在IOOlx弱光下培养，明显提高对叶百部组培苗的生根 率，生根率为95% ;生根苗经过炼苗后移栽到草炭基质中移栽成活率为99%，稳定性好。
[0037] (3)本发明有效解决了对叶百部组培苗难于生根和生根率低的难题，降低了生产 成本，为实现规模化生产和种质资源的保护提供了条件。
【具体实施方式】
[0038] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可W通过市售获得的常规产品。 阳〇例实施例1
[0040] 一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括W下步骤：
[0041] (1)外植体的选择和无菌预处理：选择无病害、健壮的百部顶芽为外植体，用无 菌水冲洗，将材料放在超净工作台上，用75%的酒精浸泡30s，再用0. 1 %的升隶溶液处理 8min，无菌水清洗4次，备用。
[0042] (2)诱导培养：将处理好的外植体切取0. 2mm茎尖，接种于诱导培养基表面，诱导 培养基的成分为：改良MS培养基中含有NAAO. 5mg/l、BAl.Omg/l、薦糖30g/l、琼脂5g/l，培 养8d后开始萌芽，初始生长较慢，经过30d的诱导培养获得健壮的无菌苗，诱导率为95%。
[0043] (3)将步骤（2)中无菌苗剪切为长1.Ocm的带芽茎段接种于增殖培养基，诱导丛 生芽，增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA2.0mg/l、KT1.0mg/l、NAA0. 2mg/l、 薦糖40g/l、琼脂5. 5g/L。培养周期20d，培养3d后开始长新芽，培养7d后开始长丛生芽。 培养到20d时，80%的苗能诱导长丛生芽，增殖倍数为5倍。
[0044] (4)生根培养：将步骤（3)中的无菌丛生芽切成带芽茎段接种于生根培养基：1/2 浓度的改良MS培养基中含有NAA2. 5mg/L、IBA1.〇111旨/1、氯化胆碱1. Og/L、薦糖40旨/1、琼 脂5g/L。生根培养前期在IOOlx弱光下培养5山再进行光照培养。培养周期为40山培养 7d后，可长出新芽。培养12d后基部膨大，形成根源基。培养40d后可形成发达的根系，生 根率达95%。 W45] 妨移栽：将步骤（4)中根系长到3cm的生根苗移出组培室，置于常溫下遮阴处炼 苗4山打开培养瓶的盖子2d，然后将组培苗取出，用清水将培养基冲洗干净，移栽植到草炭 基质中。移植后盖上塑料薄膜保湿，并进行遮阴处理，移栽后保持试验基质保持湿润且不积 水为宜。移栽3d后可萌发新的根须，移栽15d后开始长新芽，移栽50d后成活率达99%。
[0046]步骤（1)~（4)中的培养基的抑值均为5. 8~6.0,培养溫度为24°C~27°C，光 照时间为10小时/d,光照强度为20001X。 W47] 实施例2
[0048] 一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括W下步骤： W例 （1)外植体的选择和无菌预处理：选择无病害、健壮的百部顶芽为外植体，用无 菌水冲洗，将材料放在超净工作台上，用75%的酒精浸泡40s，再用0. 2%的升隶溶液处理 6min，无菌水清洗6次，备用。
[0050] (2)诱导培养：将处理好的外植体切取0. 2mm带芽茎段，接种于诱导培养基表面， 诱导培养基的成分为：改良MS培养基中含有NAA 0. 5mg/l、BA 0. 5mg/l、薦糖30g/l、琼脂 5g/l，培养IOd后开始萌芽，初始生长较慢，经过30d的诱导培养获得健壮的无菌苗，诱导率 为92%。
[0051] (3)将步骤（2)中无菌苗切割为长1. 5cm的带芽茎段接种