植物调控元件和其用图
【专利说明】植物调控元件和其用途
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请序列号61/785,245的权益，所 述申请以引用的方式整体并入本文。
[0003] 序列表的并入
[0004] 名称为"M0NS331W0. txt"的文件中含有的序列表通过电子方式提交来与本文一起 提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表是54. 4千字节（在Microsoft Windows? 中测量的大小）并且创建于2014年3月12日。 发明领域
[0005] 本发明涉及植物分子生物学、植物遗传工程和适用于调节植物中的基因表达的 DNA分子的领域。
[0006] 背景
[0007] 调控元件是通过调节可操作连接可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传 元件。这类元件包括启动子、前导区、内含子和3'未翻译区域，并且适用于植物分子生物学 和植物遗传工程领域。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供用于包含调控元件的植物和构建体中的新颖基因调控元件。本发明还 提供包含调控元件的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子。在一个实施方案中，本发明 提供可操作地连接至可转录DNA分子的本文公开的调控元件。在某些实施方案中，可转录 DNA分子相对于本文提供的调控序列是异源的。本文还提供制造和使用本文公开的调控元 件的方法，所述调控元件包括包含调控元件的构建体，和包含可操作地连接至相对于调控 元件异源的可转录DNA分子的调控元件的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子。
[0010] 因此，在一方面，本发明提供包含选自由以下组成的组的DNA序列的重组DNA分 子：（a)具有与SEQ ID N0:1-20中任何一个至少约85%序列同一性的DNA序列；(b)包含 SEQ ID N0:l-20中任何一个的DNA序列；和（c)SEQ ID N0:l-20中任何一个的片段，其中所 述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。"异源 可转录DNA分子"是指所述可转录DNA分子相对于所述DNA序列为异源的。在具体实施方 案中，重组DNA分子包含具有与SEQ ID N0:l-20中任何一个的DNA序列至少约85%、至少 约86%至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至 少约93 %、至少约94%、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %或至少约99 % 序列同一性的DNA序列。在具体实施方案中，异源可转录DNA分子包含具有农艺学重要性 的基因，如能够在植物中提供除草剂抗性或害虫抗性的基因。在其他实施方案中，本发明提 供包含如本文提供的重组DNA分子的构建体。
[0011] 在另一方面，本文提供转基因植物细胞，其包括包含选自由以下组成的组的DNA 序列的重组DNA分子：(a)具有与SEQ ID N0:1-20中任何一个至少约85%序列同一性的 DNA序列；（b)包含SEQIDN0:l-20中任何一个的DNA序列；和（c)SEQIDN0:l-20中任何 一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可 转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方案 中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
[0012] 在仍然另一个方面，本文进一步提供转基因植物或其部分，其包括包含选自由以 下组成的组的DNA序列的重组DNA分子：（a)具有与SEQ ID N0:1-20中任何一个至少约 85%序列同一性的DNA序列；（b)包含SEQ ID N0:1-20中任何一个的DNA序列；和（c)SEQ ID NO: 1-20中任何一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操 作地连接至异源可转录DNA分子。在具体实施方案中，转基因植物是相对于起始转基因植 物的任何世代的子代植物并且包含重组DNA分子。本发明还提供包含在生长时产生这类转 基因植物的重组DNA分子的转基因种子。
[0013] 在另一方面，本发明提供从含有本发明的重组DNA分子的转基因植物产生商品产 品的方法。本发明的商品产品含有可检测量的SEQ ID N0:l-20。如本文使用，"商品产品" 是指包含来源于含有本发明的重组DNA分子的转基因植物、植物部分、植物细胞或种子的 材料的任何组合物或产物。商品产品包括但不限于加工种子、谷粒、植物部分和粗粉。含有 本发明的重组DNA分子的转基因植物可用于制造通常从植物获得的任何商品产品。本发明 的商品产品含有可检测量的对应于本发明的重组DNA分子的DNA。检测样品中的此重组DNA 分子中的一种或多种可用于确定商品产品的内含物或来源。可使用检测DNA分子的任何标 准方法，包括本文公开的检测方法。
[0014] 在仍然另一个方面，本发明提供在转基因植物中表达可转录DNA分子，如具有农 艺学重要性的基因的方法，所述表达是通过获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物 并且培养所述植物来实现的。
[0015] 本文还提供一种提供转基因植物的方法，所述提供是通过用本发明的重组DNA分 子转化植物细胞以产生转化植物细胞，并且使转化植物细胞再生以产生转基因植物来实现 的。
[0016] 本发明还提供密码子重新设计大肠杆菌（Eshericha coli)(大肠杆菌（E. coli)) β-葡糖醛酸酶（GUS)编码序列；其中与原生大肠杆菌GUS编码序列相比，所述密码子 重新设计GUS编码序列在转基因植物中展示较高表达。在一个实施方案中，密码子重新 设计⑶S编码序列可选自由以下组成的组：SEQ ID Ν0:29和30。转基因植物可为单子 叶植物。在一个实施方案中，单子叶植物选自由以下组成的组：玉米（Zea mays)、水稻 (Oryza sativa)、小麦（Triticum)、大麦（Hordeum vulgare)、高粱（Sorghumspp.)、小米、 珍珠粟（Pennisetum glaucum)、粟（Eleusine coracana)、泰（Panicum miliaceum)、谷 子（Setaria italica)、燕麦（Avena sativa)、小黑麦、裸麦（Secale cereale)、福尼奥米 (Digitaria)、洋葱（Allium spp·)、菠萝（Ananas spp·)、草皮草、甘鹿（Saccharum spp·)、 掠桐（Arecaceae)、竹子（Bambuseae)、香焦（Musaceae)、生姜家族（Zingiberaceae)、百合 (Lilium)、水仙（Narcissus)、鸾尾花（Iris)、朱顶红、兰花（Orchidaceae)、美人蕉、风信 子（Hyacinthoides)和郁金香（Tulipa)。转基因植物还可为双子叶植物。在一个实施方 案中，双子叶植物选自由以下组成的组：大豆（Glycine max)、野生大豆（Glycine soja)、 棉花（Gossypium)、番前（Solanum lycopersicum)、胡椒（Piper)、南瓜（Cucurbita)、豌豆 (Pisum sativum)、苜蓿（Medicago sativa)、漠藜状苜蓿、豆类（Phaseolus)、维豆（Cicer arietinum)、向日葵（Helianthus annuus)、马铃薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、昆诺阿藜、乔麦（Fagopyrum esculentum)、角豆荚（onia siliqua)、甜菜（Beta vulgaris)、菠菜（Spinacia oleracea)和黄瓜（Cucumis sativus) 〇
[0017] 附图简述
[0018] 图la-lc展示原生大肠杆菌β -葡糖醛酸酶（GUS)编码序列（CR-Ec. uidA-l:l:4，SEQ ID N0:31)与密码子重新设计大肠杆菌⑶S编码序列（CR-Ec.uidA_ nn〇-l:l:l，SEQ ID N0:30)之间的比对。比对中之相同核苷酸由星号指示。
[0019] 序列简述
[0020] SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21 和 23 是启动子序列。
[0021] SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 和 24 是前导序列。
[0022] SEQ ID NO :25-28是扩增引物序列。
[0023] SEQ ID N0:29和30是密码子重新设计⑶S编码序列。SEQ ID N0:29包含可加工 内含子，而SEQ ID N0:30是邻接编码序列。
[0024] SEQ ID N0:31是原生大肠杆菌β-葡糖醛酸酶编码序列。
[0025] SEQ ID Ν0:32是⑶S编码序列，其具有基于SEQ ID Ν0:31的原生大肠杆菌β-葡 糖醛酸酶的可加工内含子。
[0026] SEQ ID Ν0:33、39 和 40 是 3' UTR 序列。
[0027] SEQ ID Ν0:34-37、41和44是转录调控表达元件组（ΕΧΡ)序列，其包含：5<可操作 地连接至前导序列的启动子序列，所述前导序列5'可操作地连接至内含子序列；或在SEQ ID 44的情况下，5'可操作地连接至前导序列的启动子序列。
[0028] SEQ ID N0:38是内含子序列。
[0029] SEQ ID N0:42和44分别是来源于北美萤火虫和海洋腔肠的荧光素酶蛋白质的编 码序列。
[0030] 发明详述
[0031] 本发明提供在植物中具有基因调控活性的DNA分子。这些DNA分子的核苷酸序列 提供为SEQ ID N0:1-20。这些DNA分子，例如，能够影响可操作地连接可转录DNA分子在植 物组织中的表达，因此调控可操作地连接转基因在转基因植物中的基因表达。本发明还提 供修饰、产生和使用这些分子的方法。本发明还提供包含含有本发明重组DNA分子的转基 因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物，以及其制备和使用相同方法。
[0032] 提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导本发明的一般技术人员 实践本发明。除非另外指出，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来 理解。
[0033] DNA 分子
[0034] 如本文使用，术语"DNA"或"DNA分子"是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即， 脱氧核苷酸碱基的聚合物。如本文使用，术语"DNA序列"是指DNA分子的核苷酸序列。本 文使用的命名法对应于美国联邦法规§ 1.822的标题37,并且在WIP0标准ST. 25(1998)， 附录2,表1和3的表中阐明。
[0035] 如本文使用，"重组DNA分子"是包含组合DNA分子的DNA分子，这种组合DNA分子 在没有人为干预的情况下完全不会自然出现。例如，重组DNA分子可为包含相对于彼此异 源的至少两个DNA分子的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列 的DNA分子，或通过遗传转化并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
[0036] 如本文使用，术语"序列同一性"是指两个最佳比对多核苷酸序列或两个最佳比对 多肽序列相同的程度。最优序列比对通过手动地比对两个序列，例如，参考序列和另一个 DNA序列，以在具有适当内部核苷酸插入、缺失或间隙的序列比对中最大限度地提高核苷酸 匹配的数目来建立。如本文使用，术语"参考序列"是指提供为SEQ ID N0:l-20的DNA序 列。
[0037] 如本文使用，术语"％序列同一性"或" ％同一性"是同一性分率乘以100。与参 考序列最佳比对的序列的"同一性分率"是最佳比对中的核苷酸匹配的数目，除以参考序列 中的核苷酸总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案 提供包含序列的DNA分子，所述序列在与本文提供为SEQ ID N0:1-20的参考序列最佳比 对时，与参考序列具有至少约85%同一1性、至少约86%同一1性、至少约87%同一1性、至少约 88%同一^性至少约89%同一^性、至少约90%同一^性、至少约91 %同一^性、至少约92%同一 性、至少约93%同一^性、至少约94%同一^性、至少约95%同一^性、至少约96%同一^性、至少 约97%同一^性、至少约98%同一^性、至少约99%同一^性或至少约100%同一*性。
[0038] 调控元件
[0039] 调控元件如启动子、前导区、增强子、内含子和转录终止区域（或3' UTR)在活细 胞中的总体基因表达中起整体作用。如本文使用，术语"调控元件"是指具有基因调控活性 的DNA分子。如本文使用，术语"基因调控活性"是指例如通过影响可操作地连接可转录DNA 分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接可转录DNA分子的表达的能力。因此，在植物 中起作用的调控元件，如启动子、前导区、增强子、内含子和3' UTR适用于经由遗传工程来 修饰植物表现型。
[0040] 如本文使用，"调控表达元件组"或"EXP"序列可指可操作地连接调控元件，如增强 子、启动子、前导区和内含子的群组。因此，调控表达元件组可包含例如5'可操作地连接至 前导序列的启动子，所述前导序列进而5'可操作地连接至内含子序列。
[0041] 调控元件可通过其基因表达模式来表征，例如，正性和/或负性效应如组成性表 达或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达，和其任何组 合，以及通过定量或定性指示来表征。如本文使用，"基因表达模式"是将可操作地连接DNA 分子转录至转录RNA分子中的任何模式。转录RNA分子可翻译以产生蛋白质分子或可提供 反义或其他调控RNA分子，如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小分子 RNA(miRNA)等。
[0042] 如本文使用，术语"蛋白质表达"是转录RNA分子翻译至蛋白质分子中的任何模 式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。
[0043] 启动子适用作调节可操作地连接可转录D