生物相容的和生物可吸收的衍生的壳聚糖组合物的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列号61/784467的优先 权，其内容通过引用完全并入本文。
技术领域
[0003] 本发明一般涉及生物相容的、生物可吸收的衍生的非交联壳聚糖组合物以及制造 和测试所述组合物的方法，所述组合物可以会或可能不会被1-乙基-3-[3_二甲基氨基丙 基]碳二亚胺盐酸盐（H)C)交联到凝胶/胶原以用于生物医学用途。本发明的组合物包含 被重乙酰化到程度在约15%至40%之间的N-脱乙酰（DDA)的衍生的壳聚糖。如使用由本 发明人开发的改良的急性全身毒性实验所确认的，本发明的组合物可以植入哺乳动物中而 不产生会引起提升的细胞因子IL-I β反应的有毒的生物降解物种。本发明的组合物是典 型地在约90天或更短的时间内生物可吸收的，且可制成以不同的速率被生物吸收。本发明 的组合物最初溶于pH低于6.5的水溶液。本发明的组合物具有可被调节在约0% (w/w)至 约8% (w/w)之间的酸成分，以将所述组合物定制用于需要和/或忍受不同水平的细胞毒 性、粘合性、组合物凝聚性和到所述组合物中的细胞渗透性的用途。
【背景技术】
[0004] 甲壳素是广泛存在于自然界的一种天然高分子量聚合物。它是昆虫和甲壳动物角 质层的主要成分，并且也是某些真菌和其它生物的细胞壁的一部分。甲壳素是一般通过用 强酸（如需要的话，去除钙沉积）和强碱（去除蛋白质残渣）处理来从天然来源提取。甲 壳素在通常的水溶液条件下是不溶的，且被认为是相对难加工的聚合物（难以处理）。将甲 壳素溶解以能够直接加工成纤维或其它形式需要使用缺乏吸引力的溶剂系统，它们一般是 腐蚀性的和有毒的。
[0005] 在工业水平通过甲壳素的脱乙酰水解来生产壳聚糖。甲壳素和壳聚糖是糖胺聚糖 族聚合物的一部分。壳聚糖通常是在碱存在下从甲壳素脱乙酰而获得的。壳聚糖是用于描 述线性多糖的通用名称，它们由由β-(1-4)糖苷键所连接的葡萄糖胺和N-乙酰基葡萄糖 胺残基组成的（通常葡萄糖胺的数量多N-乙酰基葡萄糖胺），且它们的组合物可溶于稀酸 水溶液。壳聚糖族包括聚β -(1-4)-N-乙酰基葡萄糖胺和聚β -(1-4)-N-葡萄糖胺，具有 影响壳聚糖化学性质的基序装饰（无论是无规或嵌段）和乙酰残余馏分。在壳聚糖的氨基 葡萄糖环上的2碳氨基允许质子化，因此使壳聚糖溶解于水（pKa兰6.5 ) (Roberts)。这允 许稳妥地将壳聚糖处理成纤维、薄膜和其它形式，以及能够制备高纯度的壳聚糖以用于生 物医学用途。
[0006] 取决于原始生物材料源和将甲壳素处理成壳聚糖的控制，聚-N-乙酰基葡萄糖胺 化合物呈现出可用水溶液处理的各种不同的物理和化学特性。这些不同是由于壳聚糖的不 同分子量、不同程度的乙酰化和污染物的存在（如共价结合的物种特异性蛋白、单一的氨 基酸和无机污染物等）造成的。
[0007] 许多注意力放在作为性功能性聚合物的壳聚糖上，因为已经报道了一些独特的生 物特性，如无毒、生物相容性和生物降解性。确实，壳聚糖被广泛认为是无毒的生物相容的 聚合物。（Keen T.等人，2005，Adv.Drug Deliv.Rev.62:3-ll("Kean"）；Ren，D.等人，2005 年，Carbohydrate Res340 (15) :2403-10( "Ren"））〇
[0008] 壳聚糖的潜在的安全的、生物相容的和生物可吸收的用途使其成为一种有吸引力 的天然材料以用于生物医学植入物。此外，脱乙酰的和部分脱乙酰的壳聚糖制剂显示出潜 在的有利的化学性质，例如高反应性、致密的阳离子电荷、强大的金属螯合能力、共价结合 蛋白质的能力以及在许多含水溶剂中的溶解度。此外，通常可以理解的是，壳聚糖能够粘附 于活体组织、用作止血剂、促进快速愈合并且具有抗菌特性。
[0009] 这些化学和生物特性现在开始被证明可用于许多医疗应用。虽然壳聚糖组合物越 来越多地在美国、欧洲和亚洲被用于体外医疗应用，如伤口组合物产品、海绵体、粉末止血 剂和抗微生物凝胶，生物相容的和生物可吸收的壳聚糖组合物尚未被批准用于体内外科用 途。
[0010] 壳聚糖尚未获得作为生物相容的和生物吸收的生物医学植入物材料的用途，至少 部分是这样，因为壳聚糖包括一大群结构上不同的化学实体，且它的生物降解性能受到多 种相互依赖的因素所影响，这使得该组合物的设计是不可预测的。壳聚糖的各种物理化学 特性，如分子量、脱乙酰程度以及在壳聚糖分子中的乙酰胺基团的分布，影响了壳聚糖功能 和生物可吸收性。（Kofuji，K.等，2005，Eur.Polymer J. 41 :2784-2791( "Kofuji"））。这 些特性、分子量和N-脱乙酰的程度（DDA)被认为是壳聚糖的生物可吸收性的两个最重要的 决定因素 。（Ren ;Kean)。
[0011] 壳聚糖的在体内降解是尚未完全清楚的，但相信是通过聚合物链的酶裂解而发生 的。（Kean ;Ren)。溶菌酶是人体中最主要的壳聚糖降解酶，但一般还可以在动物、植物和 微生物中发现其它各种壳多糖酶。（Kean)。壳聚糖的降解行为对生物相容性材料的性能 起着重要作用。降解动力学可能影响许多细胞过程，包括细胞生长、组织再生和宿主反应。 (Ren)。关于由溶菌酶降解的壳聚糖的调查显示，壳聚糖的DDA是控制壳聚糖降解的关键因 素之一。（同上）。此外，已经注意到，N-取代可影响酶促降解。（Kean)。
[0012] 体内的生物降解率和生物吸收率也经受异物包囊（纤维囊形成）的竞争过程，该 过程可最终隔开所述生物吸收组合物，如果其生物吸收率足够慢且所述异物引起适度的炎 症反应以促进包囊的增强速率的话。这种包囊对于期望的生物可吸收组合物是不希望的， 因为它可以将组合物在体内的潜在滞留时间从数月延长至数年。降低包囊的速率以及及时 清除和除去异物是所希望的，因为持久的滞留时间可导致血管和/或神经冲击以及促进感 染的不良事件。
[0013] 通过溶菌酶有效断裂的壳聚糖先决条件是，在多糖链中具有至少三个连续的 N-乙酰葡萄糖胺单体的常规分组（Aiba)，即壳聚糖的DDA足够低（〈70% DDA)，具有必要的 N-乙酰基序结构以使能（enable)系统性的酶裂解。通常，壳聚糖上的乙酰基越多，降解速 率越快。（Tomihata，K.等，1997, Biomaterials 18 :567-575 ("Tomihata"））。
[0014] 高于pH 6. 5的壳聚糖水溶性范围，其在45%和55% DDA之间（Roberts 1992)， 经常会对生物吸收和断裂的绝对速率的判断造成混淆，因为水溶性壳聚糖看起来会更 快地被生物吸收，而实际上它只是被溶解。（Freier，T.等，2005Biomaterials，26(29): 5872-8( "Freier，，））。
[0015] 作为一般事项，除了其DDA之外，壳聚糖分子的其它特性，如它的分子量、粘度、溶 解性和乙酰胺基团的分布，影响壳聚糖的生物吸收性质。
[0016] 此外，如前所述的，生物材料的生物相容性在生物吸收中起着重要作用。可通过 酶、水解或氧化的途径生物降解、但其仅略微提升局部生物材料炎症反应的生物材料，与 适度提升同样反应的生物可降解的生物材料相比，将以更慢的速度被生物吸收。有趣的 是，高DDA的壳聚糖被证明有很好的生物相容性，而报道的生物相容性在DDA减小时下降。 (Tomihata) 〇
[0017] 通常可理解的是，壳聚糖的生物吸收和生物降解要求壳聚糖具有低于70%的DDA 和超过40 %的DDA，如果聚β-(1-4) N-乙酰氨基葡萄糖胺仍然被认为是壳聚糖（溶于稀水 溶液）。纯甲壳素 （DDA近乎0. 0)已证明是生物可吸收的。（Tomihata)。含约70%和更高DDA 的壳聚糖组合物表明具有最小的生物降解，至少部分地是因为缺乏乙酰基以促进酶裂解和 /或缺乏溶解性。（参见？代丨61，1'.等，20058丨〇11^七64318,26(29):5872-8(1代丨61"）） 。
[0018] 已经发现在植入一周之内，这些高DDA的壳聚糖，虽然表现出非常良好的生物相 容性，但开始经历包囊。（Vandevord)。因此，接近70%和更高DDA的壳聚糖组合物，具有缓 慢的生物降解和包囊的速率，可能永远不会在体内被完全再吸收，并可能产生不良的包囊。
[0019] 据文献报道，具有低于70% DDA的壳聚糖已证明是生物相容的和生物可吸收的， 且被提出对生物医学用途是安全的。然而，只有具有约40-70% DDA的壳聚糖组合物已经被 证明在体内是生物可吸收的，其中聚β-(1-4)N-乙酰氨基葡萄糖胺被定义为壳多糖，或者 具有更低DDA的壳聚糖依赖于其其水溶液等于或低于pH 6. 5,如Roberts所公开的。这些 生物可吸收的壳聚糖组合物的生物相容性，尽管低于高DDA的壳聚糖，已被报道值得进一 步研究。但是，报道的发生实际生物吸收的壳聚糖的生物吸收的体内研究的数量，是非常低 的。（见例如，Tomihata)。大多数的声称研究壳聚糖生物再吸收的其它研究仅仅使用体外 酶条件（一般溶菌酶）。如所显示的，溶菌酶溶液允许分析壳聚糖的在体内生物降解的相对 敏感性，但是，它不能考虑与生物材料的生物相容性相关联的吸收和生物降解效应以及生 物降解制品的生物相容性。
[0020] DDA低于40%的壳聚糖组合物的生物相容性和生物吸收性还没有被广泛研究。这 可以部分地是因为难以获得具有较低DDA的壳聚糖的事实。（Ren)。另外，降低壳聚糖的 DDA至低于40%以实现更快速率的生物降解受挫于以下事实：具有小于40% DDA的壳聚糖 将使壳聚糖不溶于pH低于6. 5的水溶液，从而不是如Roberts所定义的壳聚糖。（见例如， Ren，Xu，J.等，1996，Macromolecules 29 :3436-3440( "Xu"）；Freier)。此外，具有低于 50% DDA的壳聚糖通常不是市售的。
[0021] 然而，在某种程度上来说，降低壳聚糖的DDA可以有利地增加其生物降解速率，传 统的观点是，生物降解太快的速率可能是不可取的，因为公知的是，生物材料的生物降解越 快，它们越可能引起急性炎症反应，因为在很短的时间内显著大量地产生低分子量化合物。 (Tomihata) 〇
[0022] 另外，制备以包括含有45% -55% DDA的水溶性范围的壳聚糖的组合物会造成不 希望的膨胀和通过组合物的流体吸收，这在生物吸收过程中可能导致植入物的尺寸和性能 的不希望的和不可预测的波动。
[0023] 如下面详述的，本发明的发明人惊奇地发现，与传统的观点和工业实践相反，包括 具有在40%和约70%之间的DDA范围的衍生非交联壳聚糖组合物的组合物在植入时是有 毒的、生物降解的和生物吸收的。本发明人还惊奇地发现，具有在约15 %和40 %之间的DDA 范围的生物相容的、无毒的和生物可吸收的生物医学壳聚糖组合物是可以制备的，在植入 后，在约90天或更小时间内可被生物吸收至少85%。因此，本发明人已不仅克服本领域技 术人员广泛持有的对包括具有在40%和约70%之间的DDA范围的壳聚糖的组合物的生物 相容性和生物可吸收性的误解，而且还实现了 ：1)对具有在约15%和40%之间的DDA范 围的生物相容的和生物可吸收的壳聚糖的惊人认识，2)使用具有在约15%和40%之间的 DDA范围的壳聚糖制备本发明的包括衍生的非交联的壳聚糖的组合物的方法，以及3)开发 了改良的急性全身毒性测试，以确保本发明的组合物在植入后不产生会引起提升的IL-I β 细胞因子反应的有毒的生物降解物种。
【发明内容】
[0024] 本发明首先涉及包含衍生的非交联壳聚糖的生物相容的和生物可吸收的生物医 学组合物，所述壳聚糖的DDA范围在约15%和40%之间，所述组合物的衍生的非交联壳聚 糖至少最初可溶于PH 6. 5的水溶液。本发明的组合物是专门用于生物可吸收的和生物相 容的可植入结构体的简单水性制备，所述结构体在约90天或更段的时间内被完全生物降 解和生物吸收。通过使生物相容材料能够被易于水性构造制备（纤维、薄膜、冷冻干燥基质 等）和被可接受地快速控制的生物吸收，本发明减少了使用者的不必要的风险，因为炎性 异物或不吸收物的长期存在可能引起粘附、包囊（encapsulation)和/或感染。
[0025] 本发明还涉及制造生物相容的、生物可吸收的组合物的方法，所述组合物包含衍 生的非交联壳聚糖（其可以是或可以不是通过EDC交联到凝胶/胶原），其具有在约15% 和40%之间的DDA范围以供生物医学使用。在一个实施方案中，本发明的组合物通过在乙 酸中将已被脱乙酰到DDA为约80%或更高的壳聚糖重乙酰化以实现DDA范围在约25%和 40%之间而制备。具体地，从在约85%至100%之间的纯高DDA的壳聚糖的再激活是优选 的。除了直接重乙酰化重乙酰化，本发明的方法可任选地包括通过与亲电试剂反应来还原 壳聚糖的游离胺官能度。
[0026] 本发明的组合物被制成以便至少最初可溶于pH低于6.5的水溶液。