一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物原生质体培养领域，具体涉及一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体 植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导，得到四倍体再生植株。
【背景技术】
[0002] 菊苣（CichoriumintybusL.)属于菊科，是多年生草本植物，为食、药及饲料三用 作物，其根部含有丰富的菊粉、低聚及超高果糖，对人体健康十分有益，亦可深加工成为低 热量的保健食品和咖啡替代品；软化菊苣可作鲜食用高档蔬菜；此外，菊苣还是一种高产 优质牧草。
[0003] 菊苣原产欧洲，于20世纪80年代初引进中国，开始了大面积试种和快速推广，具 有良好的发展潜力。但是，菊苣的育种在国内基本处于空白，现用的品种几乎全部从国外引 进，而这些国外品种在适应性和抗性等重要农艺性状上表现较差，必须加以改良。所以，我 们迫切需要开展自己的育种工作，培育出更适合中国种植条件的，具有知识产权的菊苣新 品种。
[0004] 原生质体融合（即体细胞杂交）是比较实用的生物技术之一，可以用于常规育种 方法无法完成的种间或属间远源杂交，获取更大的杂种优势，引进优秀的农艺性状（例如： 适应性，抗病性，抗逆性等），培育菊苣新品种或育种材料，丰富种质资源。原生质体培育是 实施体细胞杂交的前提和基础，而菊苣的原生质体培育技术体系在国内尚未建立；虽然国 外已有菊苣原生质体培育及融合等方面的报道（Rambaud1996)，但无论在培养效率上，还 是在技术内容及方法的实用性上，都需要加以改进和提高，才能加快我国的菊苣育种，尽快 地培养出具有中国特色的新品种。
[0005] 多倍体的离体诱导技术对菊苣的育种及改良十分有益，四倍体或三倍体等植株具 有营养体"巨型性"的特点，可以大幅度提高其收获器官--块根的产量（增产30-50% )， 同时还可提高菊苣有效成分的含量（如菊粉糖等），以及改善抗病性、抗逆性和适应性。国 内常规的菊苣多倍体诱导方法，通常是运用秋水仙素等化学药剂处理菊苣的器官，组织，愈 伤组织或多细胞团，得到的多倍体植株往往伴有混倍体和嵌合体，需要反复多次的继代，分 离培养，才能筛选出纯合的多倍体植株，其过程不但费工费时，而且纯合多倍体的诱导频 率不高。国外利用原生质体融合技术，诱导出了菊苣四倍体，但是其四倍体的诱导频率低 (Rambaud等，I"6) 〇
[0006] 因此，植物外植体培养领域的科研和实践中，需要一种利用菊苣原生质体培养，结 合秋水仙素处理，能够一次性获得高效的纯合四倍体的诱导方法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素 对菊苣原生质体进行诱导，得到四倍体再生植株。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] -种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，包括如下步骤：
[0010] 酶解步骤：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产物； 将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液；
[0011] 纯化步骤：将所述原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得 到纯化后的原生质体；
[0012] 诱导步骤：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处理，得 到加倍后的原生质体；
[0013] 细胞团和小愈伤组织培养步骤：将所述加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1 进行清洗处理，再用原生质体培养基JY2进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织；
[0014] 愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤：将所述细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基 YJ3培养基进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；
[0015] 分化步骤：将所述愈伤组织和胚状体于分化培养基JY4进行分化培养，得到再生 芽。
[0016] 上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解液包括：质量百分比 浓度为〇. 1-1. 〇%、优选为〇. 25%的纤维素酶R-10,质量百分比浓度为0. 1-1. 0%、优选为 0. 2%的果胶酶。
[0017] 上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解液中还包括：10mM的 0&(：12*21120,0.71111的1(11 2?04，质量百分比浓度为8%-12%的甘露醇，质量百分比浓度为 0? 05-0. 2%的2-(N-吗啉）乙磺酸。
[0018] 上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解处理的时间为5-6小 时，优选为5. 5小时。
[0019] 上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，含有质 量浓度百分比为〇. 1-1 %，优选为〇. 1-0. 5%，更优选为0. 3%的秋水仙素。
[0020] 上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，还含有 10mM的CaCl2 ? 2H20,0. 7mM的KH2P04和质量百分比浓度为8% -12%的甘露醇。
[0021] 上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述诱导处理的时间为1-12小 时，优选为1-5小时，更优选为3小时。
[0022] 上述方法的优选的实施方式中，所述细胞团和小愈伤组织培养步骤中，所述包埋 培养中，将固化后的原生质体薄层于24-28°C，优选为26°C，无光照培养2-3周。
[0023] 上述方法的优选的实施方式中，所述愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤中，所 述诱导培养中，温度为24-28°C，优选为24°C，光周期为10小时光照/天，光照强度为 800-1200LUX，优选为 1000LUX。
[0024] 上述方法的优选的实施方式中，所述分化步骤中，所述分化培养中，温度为 24-28°C，优选为24°C，光周期为16小时光照/天，光照强度为2000-3000LUX，优选为 2500LUX。
[0025] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0026] 1、本发明利用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导处理，且每个步骤、各个参数之 间协同作用，四倍体植株再生率较高；远高于采用原生质体融合方法诱导。
[0027]2、本发明采用的是单细胞加倍法，菊苣纯合四倍体是利用秋水仙素短时间处理单 个原生质体，最后形成的再生植株由加倍的原生质体起源的，经过离体培养，一次性形成的 多倍体植株。
[0028] 3、本发明相比原生质体融合加倍法，具有的优点为：诱导多倍体植株的倍性可控 性高，排除了原生质体融合加倍法产生6倍体及8倍体植株的可能性；由二倍体菊苣原生质 体再生的混倍体植株率和嵌合体植株率均为零，排除了组织加倍法所必需的多期继代，筛 选和纯化四倍体植株的繁琐培养过程。
【附图说明】
[0029] 图1为试验例3中，采用2种不同的诱导方法对菊苣原生质体加倍处理后，四倍体 植株再生率柱状图。
【具体实施方式】
[0030] 一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，包括如下步骤：
[0031] 步骤一、酶解：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产 物；将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液。
[0032] 具体的操作为：
[0033] (1)酶解处理：取7-14日龄、二倍体菊苣种子的无菌苗的叶片、或生长健壮的组培 苗的叶片，纵切成为2-3毫米的细条，除去叶片的中央主脉及边缘，放入酶解液中，叶片与 酶解液的质量体积比为1克：10毫升，置于黑暗条件下于30-34°C，优选为32°C，酶解5-6小 时，优选为5. 5小时，得到酶解产物；
[0034]示例性地，上述酶解处理的温度可以为30°C、31°C、33°C、34°C中的任意值或任意 二者之间的范围；上述酶解处理的时间可以为5.lh、5. 5h、5. 6h、5. 8h、6h中的任意值或任 意二者之间的范围；
[0035] 上述酶解液包括：质量百分比浓度为0. 1-1.0%的纤维素酶R-10,质量百分比 浓度为〇. 1-1. 〇 %的果胶酶，10mM的CaCl2 ? 2H20,0. 7mM的KH2P04，质量百分比浓度为 8% -12%的甘露醇，质量百分比浓度为0.05-0. 2%的MES(2-(N-吗啉）乙磺酸）；该酶解 液以0. 22ym的微孔滤膜过滤灭菌；
[0036] 示例性地，上述酶解液中的纤维素酶R-10的质量百分比浓度可以为0. 1%、 0. 2 %、0. 5 %、0. 8 %、1 %中的任意值或任意二者之间的范围；果胶酶的质量百分比浓度可 以为0. 1、0. 3 %、0. 5 %、0. 8 %、1 %中的任意值或任意二者之间的范围。
[0037] (2)收集处理：将酶解产物经过200目和400目的不锈钢筛的过滤，再加入CPW洗 液，洗出残留在培养皿中的酶解产物，再用400目的不锈钢筛过滤；再收集全部过滤后的原 生质体及CPW洗液，在500-1000rpm下离心8分钟，弃上清，收集原生质体，得到原生质体悬 液。
[0038] 步骤二、纯化：将原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得 到纯化后的原生质体。
[0039] 具体的操作为：
[0040] (1)清洗处理：向原生质体悬液中缓慢加入CPW洗液，在750rpm下离心8分钟，保 留沉淀；此过程重复2次，即离心清洗2次，得到清洗后的原生质体；
[0041] 上述的每次离心处理中，转速为750rpm，时间为8分钟，再使用玻璃吸管弃除上清 液，并向沉淀中添加10毫升的CPW洗液；
[0042] (2)纯化处理：取相等体积的22%的蔗糖溶液和清洗后的原生质体，在1500rpm下 离心15分钟；于离心管中部的分层部位，收集原生质体带；再向收集到的原生质体中添加 CPW液重新悬浮，在750rpm下离心8分钟，洗除蔗糖残液，得到纯化后的原生质体。
[0043] 步骤三、诱导：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处 理，得到加倍后的原生质体。
[0044] 具体的操作为：
[0045] (1)将纯化后的原生质体定量悬浮于秋水仙素加倍液中，得到混合悬液；每毫升 该混合悬液中包含60000个原生质体；
[0046] 秋水仙素加倍液中，除含有质量浓度百分比为0. 1-1%，优选为0. 1-0. 5%，更优 选为0. 3%的秋水仙素之外，还含有10mM的CaCl2 ? 2H20,0. 7mM的KH2P04和质量百分比浓 度为8-12%的甘露醇；该加倍液的pH值为5. 8,以0. 45ym微孔滤膜过滤灭菌；
[0047] 示例性地，上述秋水仙素的质量百分比浓度可以为0. 1%、0. 2%、0. 5%、0. 8%、 1 %中的任意值或任意二者之间的范围。
[0048] (2)加倍处理：将密封在容器中的混合悬液置于转速为20-25rpm摇床上，振荡培 养原生质体1-12小时（优选为1-5小时，更优选为3小时），诱导染色体加倍，得到加倍混 合悬液；加倍处理的外界条件为温度25°C，无光照；
[0049] 示例性地，上述加倍处理时间可以为lh、4h、6h、7h、8h、10h、12h中的任意值或任 意二者之间的范围。
[0050] (3)向加倍混合悬液中添加CPW洗液，进行3次离心处理，得到加倍后的原生质 体；
[0051] 上述的每次离心处理中，转速为750rpm，时间为8分钟，再使用玻璃吸管弃除上清 液，并向沉淀中添加10毫升的CPW洗液。
[0052] 本步骤利用秋水仙素短时间处理单个原生质体，最后形成的植株是由加倍的原生 质体起源的，经过离体培养，一次性形成的多倍体植株。
[0053] 步骤四、细胞团和小愈伤组织培养：将加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1 进行清洗处理，再用JY2液体培养基进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织。
[0054] 具体的操作为：
[0055] (1)清洗处理：向加倍后的原生质体中加入等体积的原生质体培养基YJ1，于转速 750rpm离心8分钟，保留沉淀，再向沉淀中加入原生质体培养基YJ1，得到原生质体YJ1悬 液；再将该悬液中的原生质体的培养密度调整为60000个/ml。
[0056] (2)包埋处理：在35°C预加热融化原生质体培养基JY2,再于30°C吸取密度为 60000个/ml的原生质体YJ1悬液，按照1 :1的体积比与原生质体培养基JY2混合，摇匀后 迅速转入培养皿，在其中