用于改良的显微操作和储存的方法、系统以及装置的制造方法
【专利说明】用于改良的显微操作和储存的方法、系统以及装置
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2013年1月7日提交的，格尼亚有限公司的，题为"用于改良的显微 操作和储存的方法、系统以及装置"的澳大利亚临时专利申请第2013900039号的优先权，而 且其说明书通过引用整体并入本文并且用于所有目的。 发明领域
[0003] 本发明涉及生物材料的操作和处理领域。特别地，本发明涉及用于生物材料的显 微操作的装置和方法，例如，用于生物材料的低温保存的装置和方法，所述生物材料包括人 和非人卵母细胞、胚胎和胚泡、配子和干细胞。尽管已经开发了本发明并且本发明在关于一 系列生物材料的各种显微操作情况和技术中有应用，但发现了特别的应用，在通过玻璃化 的人卵母细胞、胚胎和干细胞的低温保存中使用，如在体外受精（IVF)程序等过程中所应 用的。然而，本发明不局限于该用途。
【背景技术】
[0004] 在本说明书中使用的单数形式的词"发明人"可以用于指本发明的一个（单数）发 明人或多于一个的（多个）发明人。
[0005] 应当理解的是，本说明书中的文件，设备，行为或知识的任何讨论被包括以解释本 发明的上下文。另外，整个说明书的讨论都是由于发明人的实现和/或发明人对某些相关 技术问题的识别。此外，本说明书中的材料，如文件，设备，行为或知识的任何讨论被包括以 根据本发明人的知识和经验解释本发明的上下文，因此，任何这样的讨论不应被视为承认 任何材料构成在本文的公开内容和权利要求的优先权日当天或者之前的现有技术基础或 澳大利亚或其他地方的相关领域中的公知常识的一部分。
[0006] 所涉及的并用于人和动物胚胎的低温保存的技术是沿用已久的，并且使用合适的 技能和专门知识，对于体外受精程序，目前的技术已经在可靠性上获得了极大的提高，并且 取得了成功。就该说明书而言，关于胚胎的处理，以下术语被认为具有以下定义：
[0007] "冷冻"是液体至固态的冷却，其可以包括结晶。
[0008] "玻璃化"是液体至固态的冷却，但没有结晶。
[0009] "低温保存"是通过冷却到零度以下的温度来保存细胞的过程，典型地_196°C。
[0010] "解冻"是通过温度逐渐增加从冷冻固态改变到液体的过程。这与已经通过缓慢冷 冻技术低温保存的卵母细胞/胚胎最常见地关联。
[0011] "升温"是通过防止结晶的温度的迅速增加从玻璃化固态改变成液态的过程。这与 已经通过玻璃化技术低温保存的卵母细胞/胚胎最常见地关联。
[0012] 所了解和应用的技术涉及胚胎的收集和低温保存，其中多个步骤涉及卵母细胞的 收集和提取、其体外受精以及随后这样的受精卵和所得到的胚胎和/或后期胚泡的低温保 存和储存。所需的多数步骤和操作阶段很大程度上依赖于技术操作者的高水平专业知识和 技能。胚胎或胚泡一旦冷冻，随后可以在需要时获得，并且能够被解冻并转移至受体，由此 成功移植至子宫可导致胎儿和所产生后代的正常发育。
[0013] 最近，这种低温保存技术已经成功地应用于未受精的卵和卵母细胞。卵母细胞低 温保存涉及来自供体雌性的未受精状态的卵或卵母细胞的收集、冷冻和储存。然后可以从 储存库取出这些冷冻的卵，解冻并且在需要时可用于受精并转移至供体。
[0014] 应用于卵母细胞而不是受精卵和胚胎的低温保存技术具有某些伦理和医学优势， 并且已经进行大量的研究和实验来改善所涉及的技术。
[0015] 低温保存的过程，特别是当应用于"活的"生物材料时，涉及对所讨论生物材料的 高度损伤，特别是考虑到根据现有技术所需的多个操作步骤。除了由于物理操作所经历的 损伤，除了在通过多种处理化学溶液的移动过程中经历的渗透冲击（osmotic shock)和毒 性冲击（toxic shock)，生物材料在任何冷冻过程中还经受潜在的冰晶形成。
[0016] 为了慎重地启动远离生物材料本身的冰晶的形成，制备冷冻生物材料的传统方法 包括将材料及其周围的溶液缓慢冷却至储存温度。由于冰晶的连续形成，该传统方法不是 最佳的。已经研发了可替换的"玻璃化"方法来解决冰晶形成问题，然而，为了成功的完成， 玻璃化需要相当高的技术技能。玻璃化涉及处理溶液转化成不含任何晶体结构的玻璃样无 定形固体，接着是非常快速的冷却。非常快速的冷却使得该溶液能够获得玻璃样无定形状 O
[0017] 该冷冻或玻璃化的传统方法的应用涉及化学化合物和溶液的使用，将该化学化合 物和溶液加入生物材料中，使得冷冻处理过程中的细胞损伤最小化。这些化学化合物和溶 液被称为低温保护剂，并且包括渗透性和非渗透性溶液。渗透性低温保护剂是容易透过生 物材料膜的小分子，与生物材料的水分子形成氢键，目的在于防止其冰结晶。这样的渗透性 低温保护剂的实例是乙二醇（EG)、二甲基亚砜（DMSO)和甘油。在水中低浓度下，这些渗透 性低温保护剂可降低所得到溶液的冷冻温度，并且有助于防止和最小化冰结晶。在较高浓 度下，其在不同的冷却速率下可能不同，这样的渗透性低温保护剂可抑制典型冰晶的形成， 并且会导致固体玻璃样或玻璃化状态的产生，其中在结晶或膨胀之前水被固化。这些渗透 性低温保护剂的毒性随着其递增的浓度而增加，并且对所研究的生物材料是潜在毒性的， 因此，该生物材料必须在非常短的时间段内最少地暴露于该渗透性低温保护剂，或者，在低 温下暴露，由此使所研究的生物材料的代谢速率降低。
[0018] 与渗透性低温保护剂相反，非渗透性低温保护剂保持在细胞外。非渗透性低温保 护剂的一些实例包括双糖、海藻糖和蔗糖。双糖低温保护剂通过从生物材料内抽提出游离 水并且使胞内空间脱水来起作用。所产生的脱水作用使其可以与渗透性低温保护剂结合使 用，从而使得渗透性低温保护剂在胞内空间中的净浓度能够提高。这些技术进一步帮助渗 透性低温保护剂防止或最小化冰晶形成。
[0019] 在玻璃化的过程中，可以加入高浓度的渗透性低温保护剂，同时将生物材料的温 度控制在高于冷冻的预定水平。然而，因为这些高浓度的渗透性低温保护剂的毒性可能是 相当大的，因此不可能将生物材料在这样的温度下保持较长时间。或者，为了平衡，可以缩 短时间，此后将可包括卵母细胞或胚胎的生物材料直接投入液氮（在下文中将液氮称作 "LN 2"）中，以实现冷冻。非常快的冷却速率使低温保护剂对生物材料的负面影响最小化， 也使因给予希望的玻璃化导致的冰晶形成最小化。
[0020] 玻璃化方法涉及将生物材料暴露于数种玻璃化溶液中。通常将玻璃化溶液加入多 孔培养皿的连续孔中，其中将培养皿和溶液温热至预定温度，该温度根据所研究生物材料 的需求来决定。
[0021] 在传统的实验方案中，将生物材料物理地转移至第一个孔中的第一种溶液中，然 后使用细胞移液设备将生物材料或细胞物理地移动通过所研究的溶液进行洗涤。在预定的 时间段内在第二个、第三个和第四个孔中重复洗涤过程，直至认为生物材料或细胞已经为 低温保存作好准备。然后使用移液器或其他操作设备，用预定量的玻璃化溶液物理地吸出 生物材料。然后将含有待玻璃化的生物材料或细胞的液滴吸移至玻璃化设备上。然后将附 着有液滴和生物材料的玻璃化设备物理地转移并且直接投入或者封入被投入LN2R的容器 内或置于已经用LN2预冷的玻璃化模块的表面上。一旦生物材料和携带流体被玻璃化，就 将玻璃化设备插入位于玻璃化模块狭缝中的预冷吸管或其他储存设备中，用于随后转移至 LN 2S LN 2蒸汽中长期冷储存。
[0022] 各种玻璃化设备可用于在低温保存过程中操作样品。一些使用移液器型设 备，其中将样品吸入空心管中，然后将其直接投入溶液或LN2*。这样的设备由Irvine scientific投放市场，并且作为Cryorip贫来销售。
[0023] 其他技术使用环/钩型设备，其将具有由塑料或金属线制得的封闭环或开口的 钩子粘在茎干的末端，并且将其用于运载生物样品。这样的设备由Cryologic以商品名 fibreplug?或Cryoloop ?来销售，如公开的国际专利申请W000/21365中所限定的。
[0024] 可使用其它工具，如国际申请W002/085110中所公开的"Cryotop"是连接至一片 塑料的弹性条带。其中，将样品置于条带上，然后直接投入LN2中。
[0025] 目前的现有技术需要使用多重装置的许多胚胎操作步骤；每一个操作步骤都使失 去胚胎的机会增加。预计1-2%的胚胎丧失是由玻璃化步骤过程中的处理错误引起的。
[0026] 与之前所述的过程相关的损伤，特别是由包括卵、细胞、胚胎和胚泡的非常精细的 生物材料的重复的物理处理和操作引起的损伤影响之前所述过程和方法的存活率，并且因 此影响成功。此外，响应同渗重摩变化的活胚胎的物理动力学引起胚胎形状的快速收缩和 膨胀以及其他改变，这进一步挑战了这些生物材料的任何处理，特别是，自动化处理。许多 自动化需要控制这样的动力学以及控制各种不同的胚胎类型、流体移动和高量程的流体粘 度。显然，为了使成功的机会最大化并且使对待处理的材料的损伤最小化，非常希望使这些 精细材料的物理处理减至绝对的最小化，这应该缓和细胞收缩和膨胀。
[0027] 如上所述，玻璃化过程包括暴露胚胎或细胞于浓度渐增的低温保护剂溶液（也称 为平衡和玻璃化溶液），使得细胞内的水被逐渐移除和替换。流体的浓度，细胞所经历的流 体浓度变化的速度，该过程发生的温度和其发生所经历的时间都是最终实现胚胎存活力的 重要变量。同样重要的是传热率，即玻璃化过程中的冷却和恢复所述胚胎的升温。最后加 入"升温的"溶液使得细胞内现有的低温保护剂被除去和被水替换从而理想地使胚胎返回 到其初始状态。
[0028] 除了上述讨论，现有技术中存在许多缺点，可概括如下：这是需要非常熟练的（多 个）操作者的一个非常困难和耗时的过程。胚胎损失完全依赖于操作者的技能。技能的变 化意味着胚胎恢复（其中只是没有发现胚胎）和胚胎生存能力（胚胎没有存活下来）这两 者的结果的变化。实验室环境之间的变化（即有些实验室可能在20°C下运行，而其他将在 30°C下运行）带来问题。已知的是，温度变化或给定的温度条件能加速或降低胚胎的生物 反应。过度暴露或暴露不足可能会损坏胚胎。人类的处理时间的变化意味着一些胚胎获得 过度暴露，而其他胚胎暴露不足，即在最终溶液中过度暴露胚胎30秒可能损坏胚胎。目前 适于封闭玻璃化的耗材是热密封的，因此需要切开以重新获得样品。花费过多的时间来重 新获得样品的困难和耗时的步骤将损坏胚胎，即超过20秒。在实践中以最少的步骤移动胚 胎到浓度渐增的低温保护剂溶液，通常2-3个步骤，并且这导致细胞遭受与细胞的相当大 的收缩和随后的膨胀相关联的渗透冲击，其对细胞膜和细胞骨架造成相关的压力。
[0029] 相应地，可变性可能是当前现有技术系统的主要问题之一。玻璃化可变性可能发 生在以下几个方面：
[0030] _所使用的玻璃化设备的类型。目前市场上有超过15种。
[0031] _所使用的介质。目前有超过10家的介质供应商。
[0032] -胚胎学家的技能和经验
[0033] -实验方案（步骤时间，温度，冷却速率，升温速率，介质体积）
[0034] -环境（温度，湿度）
[0035] 由于环境的可变性，人工参与和实验方案极大地导致了生物材料的低温保存的一 致性的缺乏和所得到的低怀孕率。
[0036] 因此，期望通过提供一种自动化系统来控制环境并确保生物材料的可重复的低温 保存以消除可变性。
[0037] 有3种玻璃化设备，"封闭式"系统，"半封闭式"与"开放式"系统。"封闭式"系统是 指防止1^ 2与生物材料之间的直接接触的玻璃化系统。Cryotip#被认为是一种"封闭式" 系统。"开放式"系统是指允许1^ 2与生物材料之间的直接接触的玻璃化系统。Fibr印lug?， Cryoloop?和Cryotop?都被认为是"开放式"系统。开放式系统的问题是与必需的LN 2， 却溶液直接接触，这具有在冷冻时或者在储存过程中病原体传播到生物样品的风险。由