一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法
【背景技术】
[0002] 目前，目前线虫普遍接受的定义是Lorenzen在1981年将线虫描述为不分节，无附 肢，有假体腔，具完全消化道、神经系统和排泄系统的蠕虫状无脊椎动物。据估计后生动物 数量的60% -90%以上是线虫。
[0003] 自由生活海洋线虫是线虫动物中的一个重要类群同时是一个非常重要的功能单 位：承担海洋环境中不同营养级，促进有机物无机物再循环，补充氮的需求同时刺激微生物 的生产，在海洋底栖生态系统的能量流动和物质流动中发挥着不可或缺的作用。因在海洋 底栖生态系统的能量流动和物质循环中发挥着重要的作用，使其成为一种比较理想的实验 研究材料。另外自由生活海洋线虫作为小型底栖动物的一个重要类群，其多样性指数和群 落分布格局的变化可以作为环境监测的有效工具。以自由生活海洋线虫为代表的小型底栖 生物由于野外采样简便，物种丰富度极高，生活周期短等优点，成为海洋环境质量检测重要 指示生物，是海洋生态监测和生态体系健康评估体系的一个重要指标。
[0004] 在国内并没有系统的自由生活海洋线虫分离与培养方法，仅有的一种是海洋线虫 培养基制作及应用。现有技术方案为仅有的王摆，汝少国，王诗红.一种海洋线虫培养基及 其利记博彩app和应用（王摆，汝少国，王诗红.一种海洋线虫培养基及其利记博彩app和应用.山 东：CN101390504, 2009-03-25)。现有技术的缺点主要有以下几个方面：
[0005] 第一，目前现尚没有的系统的用于自由生活海洋线虫分离与培养的方法，然而在 实际的研究中，从野外获取和保存自由生活海洋线虫活体样品并无有效的方法，筛选具有 一定的时效性且筛选出的活体后又没有有效的方法来储存，因此导致自由生活海洋线虫分 离与培养的失败。所以，对自由生活海洋线虫分离与培养方法的需要是非常迫切的。
[0006] 第二，自由生活海洋线虫分离过程直接将底泥放入琼脂培养，在培养自由生活海 生线虫的同时也给底泥中所含大量藻类、海生细菌、原生生物提供的适宜的环境。即使很短 的时间内挑取含有自由生活海洋线虫的小块琼脂转移至新的培养基中，也不可避免的在琼 脂块中含有的藻类、海生细菌、原生生物。这样就造成了不能有效的将藻类、海生细菌、原生 生物隔离，藻类、海生细菌、原生生物的大量繁殖，影响培养基的环境因子的稳定，进而影响 自由生活海洋线虫的新陈代谢，生长发育和繁殖。另外可能造成潜在可驯化种群数目和拟 筛选目标种群数量的损失，从而导致分离与培养自由生活海洋线虫的失败。
[0007] 第三，自由生活海洋线虫的培养基制作过程中，并不需要使用高温高压消毒也可 以达到没有细菌和霉菌在培养基中生长的目的。如果一方面，所有仪器设备使用前严格洗 刷消毒，并采取适合的分离与培养方法，就可以不需要高温高压消毒。另一方面，自由生活 海洋线虫的培养基是过滤消毒海水配制而成含有一定盐度，从而对空气中细菌和霉菌具有 一定的抑制效果。
[0008] 第四，现有培养技术分离培养的自由生活海洋线虫数目太少，繁殖速度缓慢，基因 多样性太少，不利于自由生活海洋线虫种群快速稳定的发展，容易导致自由生活海洋线虫 的培养失败。
[0009] 第五，现有的培养基技术在15-27°C下培养，两个周就要更换培养基，而一般自由 生活海洋线虫的世代周期在20天左右，实际上更换培养基或多或少都会对自由生活海洋 线虫的生长发育繁殖造成影响，因此如何在保证培养基正常状态下长时间培养成为一个要 解决的问题。较短时间更换培养基，频繁转移自由生活海洋线虫，由此不仅带来大量的工作 量不说而且频繁的转移培养中的自由生活海洋线虫可能会造成一定的损伤。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题在于提供一种自由生活海洋线虫分离与培养的方法。
[0011] 本发明弥补了现有技术的缺点，为从野外获取保存自由生活海洋线虫活体样品提 供了一种新分离与培养的方法，并且为纯种筛选或者与实验室中筛选特定种的自由生活海 洋线虫提供了技术支持和可能。
[0012] 本发明是通过如下技术方案来实现的：一种自由生活海洋线虫纯种分离与培养的 方法，采用的是除菌培养，过渡培养然后传代培养；培养过程中使用三种培养基：除菌培养 基、过渡培养基、传代培养基，除菌培养使用的培养基为贫养份培养基；过渡培养使用的培 养基为富养份培养基；传代培养使用的培养基为富养份培养基，与过渡培养基不同的是琼 脂或琼脂替代品浓度更低。
[0013] 所述的除菌培养基：琼脂或琼脂替代品，其重量百分比为0. 25% -0. 3% ;营养物 质为玉米粉、大米粉或维生素，其重量百分比为〇. 05% -0. 1% ;其余为原生境过滤消毒海 水；
[0014] 所述的除菌培养基的利记博彩app为称取0. 25-0. 3g琼脂或琼脂替代品，0. 05-0. lg 营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，加过滤消毒海水至l〇〇g，放入锥形瓶中加热使琼脂全 部融化，倒入灭菌后的培养皿中自然冷却至室温，得到除菌培养基。
[0015] 所述的过渡培养基：琼脂或琼脂替代品，其重量百分比为0.3%-0.45% ;营养物 质为玉米粉、大米粉或维生素，其重量百分比为〇. 25% -0. 35% ;其余为原生境过滤消毒海 水。
[0016] 所述的过渡培养基的利记博彩app为称取0.25-0. 45g琼脂或琼脂替代品， 0. 25-0. 35g营养物质为玉米粉、大米粉或维生素，加过滤消毒海水至100g，放入锥形瓶中 加热使琼脂全部融化，倒入灭菌后的培养皿中自然冷却至室温，得到过渡培养基。
[0017] 所述的传代培养基：琼脂或琼脂替代品，其重量百分比为0. 25% -0. 4% ;营养物 质为玉米粉、大米粉或维生素，其重量百分比为〇. 25% -0. 45% ;其余为原生境过滤消毒海 水。
[0018] 所述的传代培养基利记博彩app：称取0. 25-0. 4g琼脂或琼脂替代品，0. 25-0. 45g营 养物质为玉米粉、大米粉或维生素，加过滤消毒海水至l〇〇g，放入锥形瓶中加热使琼脂全部 融化，倒入灭菌后的培养皿中自然冷却至室温，得到除菌培养基。
[0019] 本发明还提供一种自由生活海洋线虫纯种分离与培养的方法，具体步骤如下：
[0020] 1)消毒：所有使用仪器器皿严格消毒。
[0021] 2)活体筛选：从取回的样品中，选取一小块加入海水搅拌均勾，过0?5mm和0?05mm 的分样筛，〇. 5mm分样筛在上0. 05mm分样筛在下，反复清洗分样筛，将清洗液按规格倒入不 同已标记好的器皿中，在体显镜下观察，用吸管进行吸取自由生活海洋线虫；
[0022] 3)活体清洗：将吸取的自由生活海洋线虫样品滴入清洗皿，清洗皿盛有消毒的过 滤海水，进行1-3次清洗，清洗过后再将活体移入盛有消毒的过滤海水容器中；
[0023] 4)除菌培养：吸取10-20条自由生活海洋线虫滴入除菌培养基，进行除菌培养，恒 温培养，温度保持20-25 °C，每天观察记录情况，时间3-5天；
[0024] 5)过渡培养：从除菌培养基转移自由生活海洋线虫，清洗后，植入过渡培养基，恒 温培养，温度保持20-25°C，每天观察记录情况，时间14-20天；
[0025] 6)传代培养：从过渡培养基转移自由生活海洋线虫，清洗后植入传代培养基中， 恒温培养，温度保持20-25°C，每天观察记录情况，时间25天以上。
[0026] 本发明还提供一种所述方法获得的自由生活海洋线虫在自由生活海洋线虫的纯 种培养中的应用。
[0027] 经过传代培养可以获得大量的自由生活海洋线虫，完成初步的筛选为了选定特定 种群和目标种群，在传代培养基的基础上添加特定筛选成分，从而达到对特定种群和目标 种群的进一步筛选的目的；筛选出的目标种群，采用传代培养基进行纯种培养，从而源源不 断的获得纯种的自由生活海洋线虫，以供科学研究使用；可以定期进行从野外采样野生种 群经过1-6步培养后与实验室培养的种群进行，混合培养，以达到实验室连续培养的纯种 线虫的种群的复壮。
[0028] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0029] 本发明为从野外获取保存自由生活海洋线虫活体样品提供了一种新的纯种分离 与培养方式，并且为纯种筛选或者与实验室中筛选特定种的自由生活海洋线虫提供了技术 支持和可能；与现有技术相比，本发明的培养基不容易生长藻类、海生细菌、原生动物以及 杂菌；本发明不需要高温高压消毒，配制简单方便携带，这为野外采样储存提供了极大的方 便；本发明的培养基有效增加了培养基的使用时间，可以长时间使用，减少了更换培养基的 频率，更利于自由生活海洋线虫