物移入IL浮游生物 沉淀器，用水定容至1L，沉淀4小时；将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至IL容量 瓶，虹吸时，注意将虹吸管的一端放在液面稍下一点，控制流速，缓缓虹吸，以防吸出沉淀器 底部的颗粒沉淀物，再次定容至1L，制成含浮游生物水样（转移后的水样清澈透，浮游生物 清晰可见），待测；
[0063] (4)稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定，具体包括如下步骤：
[0064] 1)确定调查的浮游生物种类：调查种类包括：原生动物类、轮虫类、枝角类、桡足 类、水生昆虫类；
[0065] 2)原生动物类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，吸出0.1 ml注入血细胞计数 框中，盖上盖玻片，在光学显微镜下进行全片计数，每份样品计数5片，取平均值，然后按浓 缩的倍数换算成IL水中的数量；
[0066] 3)轮虫类、枝角类和桡足类的计数：将含浮游生物水样充分摇勾，用Iml自制的无 高刻度玻璃移液管吸取水样，并用自制的封口器封口，在40倍以下体视显微镜下进行全管 计数，每份样品计数5片，取平均值，然后按浓缩的倍数换算成IL水中的数量；
[0067] 4)水生昆虫用肉眼直接计数；
[0068] (5)转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价：应用统计分析方法比较转 基因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、浮游生物种类和数量差异，统计浮游生物多 样性指数、均匀性指数等参数，并和常规稻田进行比较，最终根据统计分析结果综合分析转 基因抗虫水稻的种植对水生生物的安全性。
[0069] (6)具体的评价结果：
[0070] 以转crylAb/lAc和cry2A基因的2个明恢63水稻为材料，在常规田间管理模式 下评价了 Bt稻对水生浮游动物的安全性。对Bt和非Bt稻田水层中的轮虫、枝角和桡足3 类浮游动物进行了 2次多样性和丰度调查，第一次调查显示Bt田中发现21个浮游动物物 种，而在非Bt田中仅鉴定了 4种，第二次在Bt田中鉴定到24个浮游动物物种，而非Bt田 中鉴定了 16种；在两次调查中浮游动物丰度在Bt田和非Bt田之间均出现了极显著差异， 非Bt田中的丰度分别比Bt田中的丰度少95%和80%。
[0071] 表1转基因和非转基因水稻小区浮游动物种类与丰度调查结果
[0074] 以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进 行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但 不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
【主权项】
1. 一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于，包括如下过程： (1) 转基因稻田和非转基因稻田布置和管理； (2) 稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定； (3) 稻田水层中浮游生物的分离； (4) 稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定； (5) 转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价。2. 根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于， 所述转基因稻田和非转基因稻田布置和管理包括如下步骤： 1) 选择地势平整、水源方便的田块3至5块，田块面积400-600m2,长宽比范围2 : 1至 1 : 1，田周边及水源无生活污水污染； 2) 将步骤1)中的田块划分成小区，田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠；为防止暴雨漫 灌，田块周边建立良好排水沟； 3) 在步骤2)中的上游小区种植转基因抗虫水稻，下游小区种植非转基因水稻，中间两 块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉，两侧的两块小区直接用水源中的水灌溉； 4) 从移栽至成熟期，不施用化学农药，人工除草，中期不晒田。3. 根据权利要求2所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于， 所述田块划分成小区的具体方案为：靠近水源的上游小区并列设置两块转基因小区，位于 转基因小区下游的下游小区并列设置4块非轩基因小区；所述两块转基因小区的上游与水 源之间分别设立连通沟渠、下游分别与中间的两块非转基因小区通过沟渠连通；所述非转 基因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通；所述4块非轩基因小区分别设置排水 沟渠。4. 根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于， 所述稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本的预处理和外源蛋白的抽提与通过酶联 免疫吸附法测定，具体包括如下步骤： 1) 水样采集及预处理：水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区，用IOml离 心管进行田间水样采集，各小区分别取5管，取上层清水，拿回室内，将每份样品转到新的 IOml离心管中，然后进行冷冻，冷冻后封上封口膜，用针头在膜上扎空，然后放入冷冻干燥 机进行浓缩至干；将干燥后的样品放入4°C低温保存，24小时内待测； 2) 淤泥样品采集及预处理：土样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区，各拔 5蔸水稻取根围淤泥，装入50ml离心管，带回室内放入-20°C冰箱冷冻，然后放入冷冻干燥 机进行浓缩至干，将干燥后的淤泥碾碎，过80目筛除去根毛，准确称取每份样品0. 5g，转入 到I. 5ml离心管中，放入4°C低温保存，24小时内待测； 3) 外源蛋白抽提缓冲液配制：取250ml锥形瓶分别加入：100mM Na2CO3, IOOmM NaCl， 5mM乙二胺四乙酸，IOmM二硫苏糖醇，50mM Na4P2O7 ^lOH2O, I % (v/v)聚乙二醇辛基苯基醚， pH值为10,即为抽提缓冲液； 4) 外源蛋白的抽提与测定：分别将步骤1)与2)中的样品加入到外源蛋白抽提缓冲液 中进行抽提，再用酶联免疫吸附试剂盒进行外源蛋白的测定。5. 根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于， 所述稻田水层中浮游生物的分离，包括水样采集、游生物的沉淀分离，具体包括如下步骤： 1) 确定调查时间：调查时间分别选在水稻的分蘖期、拔节期、孕穗期、开花期及乳熟 期； 2) 水样采集及浮游生物的沉淀分离：采用5点取样法对所有转基因小区和非转基因小 区分别选取5个点，每个点用带柄量杯采田水10L，装入桶后，先用25目过滤漏勺滤去水稻 凋落物和其它大块杂物，再用23#生物网过滤，将过滤网内的剩余物移入IL浮游生物沉淀 器，用水定容至1L，沉淀4小时；将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至IL容量瓶，虹 吸时，注意将虹吸管的一端放在液面稍下一点，控制流速，缓缓虹吸，以防吸出沉淀器底部 的颗粒沉淀物，再次定容至1L，制成含浮游生物水样，待测。6. 根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于， 所述稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定，具体包括如下步骤： 1) 确定调查的浮游生物种类：调查种类包括：原生动物类、轮虫类、枝角类、桡足类、水 生昆虫类； 2) 原生动物类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，吸出0.1 ml注入血细胞计数框中， 盖上盖玻片，在光学显微镜下进行全片计数，每份样品计数5片，取平均值，然后按浓缩的 倍数换算成IL水中的数量； 3) 轮虫类、枝角类和桡足类的计数：将含浮游生物水样充分摇匀，用Iml自制的无高 刻度玻璃移液管吸取水样，并用自制的封口器封口，在40倍以下体视显微镜下进行全管计 数，每份样品计数5片，取平均值，然后按浓缩的倍数换算成IL水中的数量； 4) 水生昆虫类：用肉眼直接计数。7. 根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于， 所述转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价的方法为：应用统计分析方法比较转 基因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、浮游生物种类和数量差异，统计浮游生物多 样性指数、均匀性指数等参数，并和常规稻田进行比较，最终根据统计分析结果综合分析转 基因抗虫水稻的种植对水生生物的安全性。
【专利摘要】本发明提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，包括如下步骤：转基因稻田和非转基因稻田布置和管理；稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本预处理和外源蛋白的抽提和测定；稻田水层中浮游生物的分离，包括水样采集、沉淀分离浮游生物；稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定，包括活体鉴定和数量计数；转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价，利用分析软件对浮游生物种类、数量、发生时期进行统计分析，得出多样性指数、均匀性指数等参数，并和常规稻田进行比较，从而对转基因抗虫水稻水生环境安全性进行评价。本发明对于系统评估转基因抗虫水稻的水生环境安全性具有实际的应用价值。
【IPC分类】A01G7/00
【公开号】CN104982241
【申请号】CN201510470544
【发明人】王永模, 刘标
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年8月4日