杀虫蛋白的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Vip3A蛋白质通过在植物中表 达来控制高粱条螟为害植物的用途。
【背景技术】
[0002] 高粱条螟Chilo sacchariphagus属鳞翅目，螟蛾科。又名甘鹿条螟，俗称高粱钻心 虫。主要分布在中国、印度、印度尼西亚和马来西亚等东亚、南亚及印度洋地区。国内分布 极广，东北、华北、华东和华南大部份地区都有发生。可为害玉米、高粱、粟、麻、甘蔗等作物。 在北方旱粮地区，主要为害玉米、高粱和粟等作物，并常和玉米螟混合发生，造成枯心苗；同 时也是南方甘蔗上的主要害虫。
[0003] 玉米是中国重要的粮食作物，随着全球温室效应的加强，近两年温度不断上升，虫 害发生种类及数量都有所提高。高粱条螟以幼虫在初期为害心叶，后期则可蛀食茎杆、叶 鞘，阻碍养分输送，使茎杆易受风折断。对产量有严重影响，通常损失可达10% -40%。为 了防治高粱条螟，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治和物理防治。
[0004] 农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因 素、创造一个有利于作物生长而不利于高粱条螟发生的农田生态环境。在越冬幼虫化蛹与 羽化之前，将高粱或玉米秸杆处理完毕，以减少越冬虫源。秸杆处理可采用粉碎、烧毁、怄 肥、铡碎、泥封等不同方法。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局 限性，不能作为应急措施，在高粱条螟爆发时就显得无能为力。
[0005] 化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是高粱条螟综合治理的重 要组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是高粱条螟大发生的情况 下，是必不可少的应急措施。高粱条螟作为蛀茎害虫，对其的防治时期把握非常重要，用药 最佳时期是卵孵盛期至幼虫蛀茎之前，否则高龄幼虫蛀入茎杆之后，将很难达到防治的目 的。目前化学防治方法主要是药液喷雾和施撒毒土。但化学防治也有其局限性，如使用不 当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系 统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
[0006] 物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如 光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广 泛的是频振式杀虫灯诱杀，它利用害虫成虫的趋光性，近距离用光，远距离用波，引诱害虫 靠近，对高粱条螟成虫的防治具有一定的效果；但是频振式杀虫灯需要每天及时清理高压 电网上的污垢，否则会影响杀虫效果；并且在雷雨天不能开灯，在操作上还有电击伤人的危 险；此外安装灯的一次性投入较大。
[0007] 为了解决农业防治、化学防治和物理防治在实际应用中的局限性，科学家们经过 研宄发现将来自于苏云金芽孢杆菌的编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗 虫转基因植物以防治植物虫害。Vip3A杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由蜡状芽孢杆 菌产生的特异性蛋白质。
[0008] Vip3A蛋白通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。 Vip3A蛋白在昆虫肠道内被水解为4种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物（33KD) 为Vip3A蛋白的毒性核心结构。Vip3A蛋白结合敏感昆虫的中肠上皮细胞，启动细胞程序性 死亡，造成中肠上皮细胞的溶解导致昆虫死亡。对非敏感昆虫不产生任何病症，不会导致中 肠上皮细胞的凋亡和溶解。
[0009] 已证明转Vip3A基因的植株可以抵抗小地老虎、草地贪夜蛾、大螟、玉米夜蛾等鳞 翅目Lepidoptera害虫的侵害，然而，至今尚无关于通过产生表达Vip3A蛋白的转基因植株 来控制高粱条螟对植物危害的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达Vip3A蛋白 的转基因植株来控制高粱条螟对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防 治和物理防治等技术缺陷。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制高粱条螟害虫的方法，包括将高粱条螟 害虫至少与Vip3A蛋白接触。
[0012] 进一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少产生所述Vip3A蛋白的宿主细胞中，所述高 粱条螟害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Vip3A蛋白接触。
[0013] 更进一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少产生所述Vip3A蛋白的细菌或转基因植 物中，所述高粱条螟害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Vip3A蛋 白接触，接触后所述高粱条螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对高粱条螟危害 植物的控制。
[0014] 在上述技术方案中，所述转基因植物可以处于任意生育期；所述转基因植物的组 织为根、叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花蕾、花药或花丝；所述对高粱条螟危害植物的控制 不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
[0015] 所述植物来自玉米、甘蔗、高粱、粟、麻或薏米。
[0016] 所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Vip3A蛋白的多核苷酸的植物。
[0017] 优选地，所述Vip3A蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列。所述Vip3A蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或 SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0018] 在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述Vip3A 蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
[0019] 进一步地，所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶 抑制剂、凝集素、a-淀粉酶或过氧化物酶。
[0020] 优选地，所述第二种核苷酸编码CrylAb蛋白。
[0021] 进一步地，所述CrylAb蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 11所 示的氨基酸序列。
[0022] 更进一步地，所述第二种核苷酸具有SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 12所示的核苷酸 序列。
[0023] 可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0024] 为实现上述目的，本发明还提供了一种Vip3A蛋白质控制高粱条螟害虫的用途。
[0025] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制高粱条螟害虫的植物的方法，包 括向所述植物的基因组中引入编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制高粱条螟害虫的植物繁殖体的方 法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，和/或取下由所述方法获得的植 株上具有繁殖能力的组织进行培养，从而产生含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植物 繁殖体。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制高粱条螟害虫的植物的方法，包 括：
[0028] 种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码Vip3A蛋白的多 核苷酸序列；
[0029] 使所述植物繁殖体长成植株；
[0030] 使所述植株在人工接种高粱条螟害虫和/或高粱条螟害虫自然发生危害的条件 下生长，收获与其他不具有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损 伤和/或具有增加的植物产量的植株。
[0031] 本发明中所述的"植物繁殖体"包括但不限于植物有性繁殖体和植物无性繁殖体。 所述植物有性繁殖体包括但不限于植物种子；所述植物无性繁殖体是指植物体的营养器官 或某种特殊组织，其可以在离体条件下产生新植株；所述营养器官或某种特殊组织包括但 不限于根、茎和叶，例如：以根为无性繁殖体的植物包括草莓和甘薯等；以茎为无性繁殖体 的植物包括甘蔗和马铃薯（块茎）等；以叶为无性繁殖体的植物包括芦荟和秋海棠等。
[0032] 本发明中所述的"接触"，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器 官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达 杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或 具有产生杀虫蛋白的微生物。
[0033] 本发明术语"控制"和/或"防治"是指高粱条螟害虫至少与Vip3A蛋白接触，接 触后高粱条螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，高粱条螟害虫通过摄食植物 组织至少与Vip3A蛋白接触，接触后全部或部分高粱条螟害虫生长受到抑制和/或导致死 亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种 效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培 养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列的控制高粱 条螟害虫的植物和/或植物繁殖体，在人工接种高粱条螟害虫和/或高粱条螟害虫自然发 生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不 限于改善的茎杆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Vip3A蛋白对高粱条螟的"控 制"和/或"防治"作用是可以独立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"高粱条螟害虫 的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物（含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸 序列）的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，Vip3A蛋白和/或可控制高粱条 螟害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响Vip3A蛋白对高粱条螟的"控制" 和/或"防治"作用，也不能导致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另 一种物质实现，而与Vip3A蛋白无关。通常情况下，在大田，高粱条螟害虫摄食植物组织的 过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种高粱条螟害虫和/或高粱条螟害虫自然 发生危害的条件下，如转基因植物（含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何组织存 在死亡的高粱条螟害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的高粱条螟害虫、和/或与非转基 因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过 高粱条螟害虫至少与Vip3A蛋白接触以实现控制高粱条螟害虫的方法和/或用途。
[0034] 在本发明中，Vip3A蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry 类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因 植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物 (第1亲本）可以通过遗传工程操作表达Vip3A蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通过 遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本 杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0035] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本 发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
[0036] 在分类系统上，一般主要根据成虫翅的脉序、连锁方式和触角的类型等形态特征， 将鳞翅目分为亚目、总科、科等，而螟蛾科是鳞翅目中种类最多的科之一，全世界已发现1 万种以上，仅中国记录就有几千条。大部分螟蛾科昆虫是农作物的害虫，多数以蛀茎形式为 害，如玉米螟和二化螟。尽管高粱条螟与玉米螟、二化螟等同属于鳞翅目螟蛾科，除了在分 类标准上存在相似性，在其它形态结构上则存在极大差异；就好比植物中的草莓与苹果一 样（同属于蔷薇目蔷薇科），它们都有花两性，辐射对称，花瓣5片等特征，但是其果实以及 植株形态却是千差万别。高粱条螟不管是从幼虫形态还是成虫形态上来看，都具有其独特 的特征。如背部纵线，在农民中就有流传着"高粱玉米谷，背线三四五"，表示同属于螟蛾科 的高粱条螟、玉米螟和粟灰螟在背线数量上就存在明显的差异。而背部纵线下就是背血管， 背血管是昆虫循环器官的重要组成部分，内里充满了有昆虫"血液"之称的血淋巴。因此体 表形态上看似细微的背线数量的差异，体现的却是背血管的差异，是昆虫循环系统上的差 异。
[0037] 同属螟蛾科的昆虫不仅在形态特征上存在较大差异，同时在取食习性上，也存在 差异。例如同为螟蛾科的三化螟仅为害水稻，极少为害其它禾本科作物。而高粱条螟未见 有报道对水稻造成为害，更多的是对南方的甘蔗，北方的玉米、高粱和谷子造成为害。取食 习性的不同，也暗示着体内消化系统所产生的酶和受体蛋白不同。而消化道中产生的酶 是Bt基因起作用的