一种诱导金铁锁愈伤组织产生花青素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及金铁锁愈伤组织诱导和金铁锁愈伤 组织花青素形成的调控方法。
【背景技术】
[0002] 金铁锁（/??蕭(asi/efle W. C. Wu et C. Y. Wu)又名独定子、娱蚁七等， 属于石竹科金铁锁属多年生草本，主要分布于我国贵州、云南、四川、西藏等地，生长在海拔 2000~3800 m的砾石山坡或石灰质岩石缝中。金铁锁是一种濒危药用植物，其根入药，具 有散淤止痛、排毒止血等功能，1991年作为稀有濒危物种被列入《中国植物红皮书》第一册， 1999年作为国家二级保护植物被列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》中。金铁锁 在云南民间药用历史较长，利用现代科技手段研制的中成药制剂有百灵草散、跌打止痛膏、 金骨莲胶囊等。金铁锁植株茎多呈紫绿色，开花期间花瓣为紫红色，即金铁锁植株的细胞有 合成天然色素的能力，因此，在利用其根的同时，综合开发该物种的天然色素亦前景广阔。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种诱导金铁锁愈伤组织产生花青素的方法，丰富了人们所需的天 然植物色素的种类，也为金铁锁这一珍稀资源的综合开发利用开辟了新途径。
[0004]本发明采用的技术方案：先以金铁锁无菌苗为外植体诱导产生愈伤组织，再通过 对植物生长调节物质浓度和光照强度的调节以优化愈伤组织花青素形成的条件。
[0005] 具体步骤如下： 步骤1 :采用金铁锁无菌苗作为外植体，置于MS培养基、加6-BA 0~3. 0 mg/L和IAA 0~2. 0 mg/L进行培养，诱导获得愈伤组织； 步骤2 :选择疏松或致密的愈伤组织，以MS为基本培养基，加6-BA 0~2. 5 mg/L和NAA 0~2. 5 mg/L在光照0~2500 Ix条件下进行培养，7 d后白色愈伤组织上诱导红色花青 素生成； 步骤3 :挑选步骤2得到的含有花青素的愈伤组织进行继代培养，以MS为基本培养基， 外加 6-BA I. 0 mg/L+NAA 0? 5 mg/L+KT 0? 3 mg/L+2, 4-D 0 ~2. 0 mg/L 培养，30 d 后花青 素明显积累； 步骤4 :选择相同培养条件下色素积累的愈伤组织，以盐酸-甲醇为提取剂，在不同 的料液比、不同提取时间及不同提取温度下优化色素提取条件，并以紫外分光光度计在 200~650 nm下扫描。
[0006] 其中，步骤1中的培养条件为：温度24~26°C、光照强度1000 lx、光照时间12 h/ d〇
[0007] 步骤3的培养条件是：温度24~26 °C，光照强度2000 lx、光照时间12 h/d。
[0008] 步骤4中盐酸-甲醇提取剂的浓度为1%~3%。
[0009] 步骤4中不同的料液比、不同提取时间及不同提取温度是指料液比在1:10~1:50 之间、提取时间在5~20 h之间、提取温度在4~50 °C之间。
[0010] 作为优选方案，步骤1中诱导愈伤组织的外植体为金铁锁无菌苗的芽，诱导愈伤 组织的植物生长调节物质为6-BA 2. 5 mg/L+IAA 0. 5 mg/L，培养温度为25 °C，光照强度为 2000 lx，光照时间为12 h/d。
[0011] 作为优选方案，步骤2中选取质地疏松的愈伤组织，诱导花青素的植物生长调节 物质为 6-BA 0? 5 mg/L+NAA I. 5 mg/L。
[0012] 作为优选方案，步骤2中诱导花青素产生的光照强度为2000 lx，光照时间为12 h/d〇
[0013] 作为优选方案，步骤3中愈伤组织积累花青素的条件为MS基本培养基外加6-BA I. 0 mg/L、NAA 0? 5 mg/L 和 KT 0? 3 mg/L。
[0014] 作为优选方案，步骤4中金铁锁愈伤组织花青素最大吸收峰在n=530nm，色素含 量表示为A530=Abs ;以3%的盐酸-甲醇为提取剂、料液比为1:10、提取时间20 h、提取温 度30°C时提取。
[0015] 本发明达到的有益效果： (1)由于人工合成色素多对人体健康存在一定的危害性，而天然色素无毒副作用。本发 明以金铁锁无菌苗的芽为外植体，诱导产生愈伤组织并继代增殖，再选择适宜的植物生长 调节物质和光照条件，从而诱导其愈伤组织积累花青素。
[0016] (2)本发明获得的花青素是金铁锁愈伤组织细胞生物合成的天然色素，为黄酮类 物质，具有一定的生理活性，可用于食品、医药等行业，以满足人们对天然色素的需求。
【附图说明】
[0017] 图1为不同植物生长调节物质组合（6-BA、NAA)对金铁锁愈伤组织花青素诱导的 影响； 图2为不同光照强度和2, 4-D对金铁锁愈伤组织花青素积累的影响； 图3为金铁锁愈伤组织花青素的紫外吸收光谱。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0019] 本发明的技术方案具体步骤如下： (1) 外植体选择与愈伤组织的诱导：采用金铁锁无菌苗(茎、叶和芽）作为外植体，置于 MS培养基、加6-BA 0~3. 0 mg/L和IAA 0~2. 0 mg/L在温度（25 ± I) °C、光照强度 1000 Ix和光照时间12 h/d的条件下培养，诱导获得愈伤组织； (2) 花青素的诱导与积累：选择不同质地(疏松或致密）的愈伤组织，以MS为基本培养 基，加6-BA 0~2. 5 mg/L和NAA 0~2. 5 mg/L，在光照0~2500 Ix下培养，7 d后白色 愈伤组织上诱导红色花青素生成；挑选少量含有花青素的愈伤组织进行继代培养，以MS为 基本培养基，外加 6-BA LO mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.3 mg/L+2,4-D 0 ~2.0 mg/L 在温 度（25 ± I) °C，光照强度2000 Ix和光照时间12 h/d的条件下培养，30 d后花青素明显 积累。
[0020](3)金铁锁愈伤组织色素的提取：选择相同培养条件下色素积累的愈伤组织(用滤 纸吸干愈伤表面水分)，以1%~3%盐酸-甲醇为提取剂，在不同的料液比（1:10~1:50)、 不同提取时间（5~20 h)及不同提取温度（4~50 °C)下优化色素提取条件，并以紫外分 光光度计在200~650 nm下扫描。
[0021] 优选的，诱导愈伤组织的外植体为芽，愈伤组织的诱导植物生长调节物质为6-BA 2.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L，培养温度为（25 ± I) °C，光照强度为2000 lx，光照时间为12 h/d〇
[0022] 更优选的，选取的愈伤组织要求质地疏松，诱导花青素产生所用的植物生长调节 物质为6-BA 0. 5 mg/L+NAA I. 5 mg/L。如表1及图1所示。图1中，A为白色愈伤（6-BA 2.0 mg/L+NAA LO mg/L);B 为紫红色愈伤（6-BA 0.5 mg/L+NAA LO mg/L);C 为紫色愈伤 (6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L) 更优选的，诱导花青素产生的光照条件为2000 lx(如表2和图2所示)。更优选的，愈 伤组织花青素积累的条件为在不添加2, 4-D的情况下(如表2和图2所示)，外加6-BA I. 0 mg/L、NAA 0? 5 mg/L 和 KT 0? 3 mg/L。
[0023]图 2 中，D、E、F、G、H、I 分别表示不同光照强度（500 lx、1000 lx、1500 lx、2000 lx、2500 lx)对花青素积累的影响程度，其中光照强度为2000 lx时（H)色素积累效果最 好；J、K表示2, 4-D添加量对色素积累的影响，其中不添加2, 4-D时（K)色素积累效果明显 另外，从图3可知，金铁锁色素最大吸收峰在n=530 nm处，色素含量可表示为A53tl=Abs (