一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法和所育菌株的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食用菌培育领域，具体涉及一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方 法和所育菌株。
【背景技术】
[0002] 蛹虫草（Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，是我国传统的重要食药用菌之 一，也是卫生部批准的新资源食品，现在称为食品新原料，允许作为食品直接食用。虫草素 是蛹虫草生物活性成分中最重要的一种，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、治疗白血病 等作用。虫草素价格昂贵，化学合成目前在实验室能够实现，但是由于条件限制不能实现生 产，所以目前市场上销售的虫草素主要从蛹虫草培养物中提取分离得到，因此选育高产虫 草素蛹虫草菌株能够大大提高虫草素产量，对降低虫草素的价格以及扩大临床应用具有重 要意义。
[0003] 离子束注入诱变技术应用于生物诱变育种领域起源于20世纪80年代，起初主要 用于选育水稻、小麦、玉米等农作物，后逐渐应用到微生物菌株选育中，专利文献"低能N +注 入诱变选育灵芝菌株的方法及所选育的菌株"（专利号：ZL 201010550775.8)采用氮离子 束诱变选育灵芝，获得产量提高15. 9%的菌株。专利文献"银耳菌株离子束注入诱变选育 方法及所育的一个银耳菌株"（专利号：ZL201310228604. 7)采用氮离子束诱变选育银耳菌 株，得到产量提高13. 5%的菌株。虽然离子束注入诱变是本领域的一种已知的技术，已经有 文献报道采用离子束注入诱变选育真菌菌株，但是不同种类的微生物对离子束注入诱变能 量及剂量的承受能力不同，即使同一菌种的不同菌株之间也仍然存在较大差异，因此对于 每一个菌株都有一个最佳诱变剂量范围，在此条件下菌株突变率最高，经过反复诱变才能 够获得更多的正突变菌株，这个最佳条件的获得对菌株诱变选育意义重大，而且由于微生 物菌株的个体差异是不能照搬应用的，必须经过大量实验优化才能得到。
[0004] 因此有必要找到一种适合特定蛹虫草出发菌株（蛹虫草菌株CM-3)的氮离子束注 入诱变最佳条件，从而筛选得到一种高产虫草素及菌丝体的蛹虫草菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供蛹虫草菌株选育的新途径，从而获得高产虫草素及菌丝体的 蛹虫草菌株资源。
[0006] 本发明提供了一种N+离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法及所育的一株生长 速度快、菌丝体产量高且高产虫草素的蛹虫草菌株。
[0007] 本发明首先提供一种离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)蛹虫草菌株离子束注入诱变前样品的处理方法优化：
[0009] 本发明的发明人以北京市辐射中心微生物实验室保存的蛹虫草菌株CM-3为出发 菌株，进行氮离子束注入诱变。由于离子束注入诱变是在真空状态下完成的，因此要保证注 入前蛹虫草孢子存活率最高才能保证注入诱变效果最佳。首先要研宄合适的孢子培养时 间，保证孢子活力最强；其次研宄合适的溶剂保护孢子在干燥时受到最少的损伤，保证孢子 的存活率最高；然后研宄孢子悬液稀释浓度对涂布单层菌膜的影响，保证涂布到金属培养 皿上的孢子是单层的，能够均匀的接受带电离子的注入；最后研宄干燥时间对涂布的孢子 存活率的影响。通过对上述条件的优化找到样品制备的最优条件，保证离子束注入诱变前 样品的存活率最尚。
[0010] 在本发明中，所述蛹虫草菌株离子束注入诱变前样品的处理方法为：蛹虫草孢子 由液体培养获得，将固体菌种在25°c恒温条件下以150r/min的转速摇床培养7d获得液体 培养物，用200目细胞筛过滤所述液体培养物得到孢子悬液，以液体培养基为稀释剂稀释 100倍获得浓度为3. 6 X IO5个/mL的孢子悬液，吸取0.1 mL所述稀释后的孢子悬液涂布到 金属培养皿上，无菌风吹干后在2-8h内做离子束注入诱变；本发明的发明人通过大量实验 发现经过此条件下能保证蛹虫草孢子的存活率最高。
[0011] 2)在真空度为KT3Pa条件下，采用连续注入方式对金属培养皿上的蛹虫草孢子进 行N+离子束注入诱变，能量为30kev，剂量为3 X 10 14ions/cm2-6 X 1014ions/cm2,获得诱变后 的蛹虫草孢子。
[0012] 3)培养诱变后的蛹虫草孢子，通过平板初筛筛选得到菌丝生长速度快、菌丝密度 大、色素颜色深、菌落较规则等特征的蛹虫草菌株；
[0013] 4)将步骤3)筛选到的蛹虫草菌株进行液体发酵培养，然后采用高效液相色谱法 测定发酵液中虫草素含量，筛选得到正突变菌株；
[0014] 5)将筛选得到的正突变菌株采用优化后的培养工艺液体培养，然后恒温静置培 养，得到虫草素产量高的蛹虫草发酵液。
[0015] 本发明还提供了采用本发明的离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法选育的一 株蛹虫草菌株（Cordyc印s militaris)，其保藏号为CGMCC No. 9818,于2014年10月22日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研宄所，邮政编码：100101。
[0016] 蛹虫草菌株CGMCC No. 9818的菌学特性：
[0017] 本发明所提供的蛹虫草菌株具有优异的虫草素生产性能，其虫草素产量比出发菌 株提高8. 85倍。菌株固体培养形态：固体PDA平板上菌落生长旺盛，菌丝浓密，菌落背面颜 色明显比出发菌株变深，菌丝密度明显大于出发菌株，菌落背面颜色为橘红色，颜色比出发 菌株深。菌株液体培养形态：液体培养基中布满直径大小约为2-3mm的白色菌丝球，液体透 明澄清。显微镜观察形态：突变菌株无性阶段分生孢子为球形，大小为2-4 ym，萌发后为椭 圆形及棒状，菌丝有少量分枝。
[0018] 本发明还提供了所述蛹虫草菌株CGMCC No. 9818在液体发酵生产虫草素及菌丝体 中的应用。
[0019] 其中，液体发酵培养基的组成成分包括：蔗糖10_30g/L，蛋白胨10-30g/L，磷酸 二氢钾0.5-2. Og/L，硫酸镁0.5-1. Og/L，pH自然；配制时将各原料加热溶解，121°C，灭菌 30min ；
[0020] 液体发酵的培养条件包括：首先在25-28°C的恒温条件下，以150-180r/min的转 速摇床培养5-7d，然后于25°C光照培养箱中静置培养20-30d获得含虫草素的培养液，吸取 培养液用〇. 22 y m无菌滤膜过滤后HPLC方法测定虫草素含量。
[0021] 本发明还提供了所述蛹虫草菌株CGMCC No. 9818在固体培养生产虫草素中的应 用。本发明所提供的方法还包括通过固体培养蛹虫草菌株CGMCC No. 9818生产核苷类物质， 所述核苷类物质包括腺苷、尿苷、鸟苷。
[0022] 其中，固体培养基配方为：所述固体培养中所使用的固体培养基由培养基质和营 养液组成。
[0023] 其中，培养基质选自燕麦、大米、大麦、小麦、小米和高粱中的至少一种，优选为燕 麦。
[0024] 营养液的组成成分包括：葡萄糖5-30g/L，蛋白胨l-30g/L，酵母粉l-10g/L，磷酸 二氢钾 0. 5-2g/L，硫酸镁 0. 5-1. Og/L。
[0025] 其中，相对于100g的培养基质，营养液的用量为120mL-140mL。
[0026] 所述营养液的配制方法包括将各组分按比例混合并加热溶解于蒸馏水中，在 121°C，灭菌30min，pH值自然。
[0027]固体培养条件为：灭菌的固体培养基冷却后，接入液体种子液，均匀的洒在固体培 养基表面。20-25°C恒温避光培养，3-7d菌丝长满培养基表面，在超净台内用无菌镊子将培 养基上层的菌丝及米粒打散成小颗粒，平铺在培养瓶中。放入18_25°C光照培养箱中培养， 设定白天为8h，温度为22-23°C，光照强度为12001u X，黑夜为16h，温度为18-20°C，关闭光 照，1-2天后菌丝变为橘色然后越来越深，最后菌丝全部长满，再继续培养20-30d。将固体 培养物取出50 °C烘干后粉碎。
[0028] 本发明的有益效果：本发明所提供的离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法， 得到了针对蛹虫草菌株的N +离子束注入诱变的最佳剂量范围，以本发明所提供的方法诱 变选育蛹虫草菌株，可以使得诱变后的蛹虫草孢子保持较高的突变率，突变率可以达到 15. 1%-21. 3%，能够筛选得到更多高产虫草素的蛹虫草突变菌株，更大的开发了蛹虫草菌 株资源。
[0029]蛹虫草菌株（Cordyceps militaris)，其保藏号为 CGMCC No. 9818,于 2014年 10 月 22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研宄所，邮政编码：100101。
【附图说明】
[0030] 图1为不同注入剂量对蛹虫草菌株存活率的影响
[0031] 其中：横坐标数字1-14分别代表不同的离子束注入剂量，1-14的注入剂量分别 为：I X 1012i〇ns/cm2、5 X 1012i〇ns/cm2、I X 1013i〇ns/cm2、5 X 1013i〇ns/cm2、I X 1014i〇ns/cm2、 2X 1014i〇ns/cm2、3 X 1014i〇ns/cm2、4 X 1014i〇ns/cm2、5 X 1014i〇ns/cm2、6 X 1014i〇ns/cm2、 7 X 1014i〇ns/cm2、8 X 1014i〇ns/cm2、9 X 1014i〇ns/cm2、I X 1015i〇ns/cm2〇
[0032] 图2为离子束注入诱变蛹虫草菌株突变率
[0033] 其中：横坐标数字1-14分别代表不同的离子束注入剂量，1-14的注入剂量分