用于在宿主细胞中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明可以被列入生物技术领域；其涵盖了包含例如启动子、作为增强子的同源 区（hr)、转录调节因子的编码序列（例如杆状病毒Ac-ie-OlcDNA)或其任意组合，且能够提 高重组蛋白生成质量和效率的核酸序列。此外，本发明还指向：包含上述本发明核酸序列的 载体本身；以所述序列或载体所感染、转化或转染的细胞；以及，使用上述序列、载体或细 胞来生成蛋白的方法。
[0002] 杆状病毒表达载体体系（BEVS)是一种已建立完善的方法，用于生成用作疫苗、 治疗分子或诊断试剂的重组蛋白。BEVS因其过度表达潜力及快速发展速度，而成为用于 生成任何用途的重组蛋白的最诱人选择之一。工业中最常用于重组蛋白表达的杆状病毒 基于苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica)多核多角体病毒（AcMNPV)，以草地贪夜蛾 (5口〇(1(^七6四^〇^丨口61(^)9(5€9)或21(5€21)昆虫细胞为合适表达宿主（1)，并以粉纹夜 蛾（Trichoplusia ni，或T.ni)昆虫幼虫为活生物工厂（2)。BEVS开发于80年代（3)，自 此以来，已在杆状病毒感染的昆虫细胞中成功生成了从胞质酶到膜结合蛋白的数百种重组 蛋白。
[0003] 人们努力提高BEVS的生产力（4)。有各种转移载体可用于构建编码驻留融合蛋 白的重组杆状病毒，这些蛋白据报告能够提高蛋白表达（包括麦芽糖结合性蛋白、谷胱甘 肽S转移酶、SUMO和KDEL驻留信号）。提高表达蛋白稳定性的其他相关研宄集中在杆状 病毒基因组的两个基因上，其对细胞培养物中的病毒生长并非必需，称为chiA(几丁质酶） 和cath(组织蛋白酶）。ChiA的删除似乎可以通过在内质网上积累蛋白和通过细胞分泌 途径加工蛋白，来提高分泌性蛋白的生成。此外，防止组织蛋白酶的形成，也可以有助于提 高chiA-病毒的产物的稳定性。新型昆虫细胞系，例如来自T.ni的High-Five TM(Hi-5)或 BTI-TnA〇38细胞系近期被开发出来，以提高杆状病毒生产力，使得异源蛋白最终回收量得 到显著提高（5、6)。
[0004] 加速重组蛋白表达，从而能够在昆虫的细胞机器被杆状病毒感染严重损坏之前进 行蛋白表达，将会是BEVS的一项重要改进。由常规强病毒启动子多角体蛋白（polyhedrin， 即polh)或plO基因所驱动的晚期表达，在外源蛋白翻译后修饰中具有严重不利条件。杆 状病毒启动子能够比常规使用的Polh或plO启动子更早地启动表达，因此其特性在于可用 作异源蛋白生产，但其生产力降低（7)。
[0005] 改进BEVS的另一种可能是，通过减少病毒诱导的细胞死亡，在感染后晚期更好地 保存细胞完整性。降低感染后晚期因 BEVS导致的昆虫细胞机器严重损坏，将不仅增加可用 于生产和积累重组蛋白（分泌或未分泌）的时间，还为复合蛋白的折叠或生成蛋白的所有 翻译后修饰提供更多时间。
[0006] 已经测定出一些杆状病毒DNA元件参与启动了病毒传播所必需的后期表达因子 的基因。其中之一为AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica)多核多角体病毒） 的立即早期（ie)蛋白（immediate early protein) IE-I及其剪接变体ΙΕ-0。因其内部翻 译起始，翻译由Ac-ie-01基因编码的AcMNPV mRNAs会得到IE-O和IE1。两者均由于具有 作为转录调节因子的能力（8)而被认为是杆状病毒基因表达的关键调节因子。AcMNPV IE-I 合成于感染极早期，是67-kDa的二聚DNA结合性蛋白，在质粒转染试验中，它通过其N端酸 性结构域的活性来刺激转录（9,10)。IE-I在细胞核中累积，且在晚期中被保持于此（11)。 IE-I作为同源二聚体与杆状病毒同源区域（hr)序列的结合，能增强IE-I的反式激活，所述 同源区域充当转录增强子以及病毒DNA复制起点。AcMNPV IE-O是72. 6-kDa、含636个氨 基酸的蛋白，它由orf 141 (exonO)所编码的38个氨基酸、iel上游未翻译前导所编码的16 个氨基酸以及IE-I蛋白的全部582个氨基酸所组成。因此，除了融合在N端的额外54个 氨基酸外，最终产物与IE-I -模一样。大概是因为其共有序列，IE-O和IE-I具有相同的 生物化学活性，包括结合hr增强子和转录调控。
[0007] 需要新型的替代型BEVSs，允许a)比使用polh或PlO启动子的商用BEVS更强的 表达，和b)降低病毒导致的细胞损伤，允许在杆状病毒体系中进行长期表达。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了用于使用BEVS改进重组蛋白表达的方法及其产物。
[0009] 以下各项为能够实现该改进表达的优选实施例：
[0010] 1.含有能够高于内源水平地表达充当转录调控因子的蛋白IE-1、IE-O和/或其 片段的核酸序列的重组杆状病毒，其中所述核酸选自：
[0011] (a)含有如SEQ ID NO: 1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
[0012] (b)与SEQ ID NO: 1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70%、优 选为至少75 %、更优选为至少80 %、更优选为至少85 %、更优选为至少90 %、最优选为至少 95%，并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
[0013] (C)编码含有如SEQ ID N0:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列； 以及
[0014] (d)编码了与SEQ ID N0:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少 70 %、优选为至少75 %、更优选为至少80 %、更优选为至少85 %、更优选为至少90 %、最优 选为至少95%并能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列。
[0015] 2.根据第1项所述的重组杆状病毒，进一步包括至少一个充当增强子区域、并可 操作地连接在任何适用于驱动重组蛋白表达的启动子上的重组同源区域（hr)。
[0016] 3.根据第2项所述的重组杆状病毒，其中所述重组同源区域（hr)是如SEQ ID N0:27(hrl)所示的序列。
[0017] 4.根据第2或3项所述的重组杆状病毒，其中所述可操作地连接在所述重组同源 区域（hr)上的启动子选自如下核酸：
[0018] (a)含有如SEQ ID NO: 10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
[0019] (b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO: 10-16中任一项所示的核 苷酸序列的序列一致性为至少70%、优选为至少75%、更优选为至少80%、更优选为至少 85%、更优选为至少90%、最优选为至少95%的核酸序列。
[0020] 5.根据1-4中任一项所述的重组杆状病毒，包含一核酸序列，该核酸序列含有重 组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID N0:17-26的增强子区域的组合。
[0021] 6.根据1-5中任一项所述的重组杆状病毒，进一步包括编码重组蛋白的核酸序 列，其中所述核酸序列可操作地连接在选自第1-5项中的核酸序列。
[0022] 7.适用于制备根据1-6中任一项所述的重组杆状病毒的转移载体，包括用于高于 内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-I和/或其片段的序列，还包括适用于 在杆状病毒中整合或转位的核酸序列。
[0023] 8.根据第7项所述的转移载体，还包括作为增强子区域的至少1个重组同源区域 (hr)，可操作地连接在适用于驱动重组蛋白表达的任何启动子上。
[0024] 9.根据第8项所述的转移载体，其中所述重组同源区域（hr)是如SEQ ID NO:27(hrl)所示的序列。
[0025] 10.根据第8或9项所述的转移载体，其中启动子可操作地连接在选自如下各核酸 的重组同源区域（hr):
[0026] (a)含有如SEQ ID NO: 10-16任一项所示的核苷酸序列的核酸；
[0027] (b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与如SEQ ID NO: 10-16任一项所示的核 苷酸序列的序列一致性为至少70%、优选为至少75%、更优选为至少80%、更优选为至少 85%、更优选为至少90%、最优选为至少95%的核酸序列。
[0028] 11.根据第7-10项中任一项所述的转移载体，包含一核酸序列，该核酸序列含有 重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID N0:17-26的增强子区域的组合。
[0029] 12.根据第7-11项中任一项所述的转移载体，还包括编码重组蛋白的核酸序列， 其中所述核酸序列可操作地连接在选自第7-11项的核酸序列上。
[0030] 13.根据第7-11项中任一项所述的转移载体，不含编码重组蛋白的核酸序列。
[0031] 14.根据第7-13项中任一项所述的转移载体，其特征在于所述转移载体为杆粒。
[0032] 15.根据第7-14项中任一项所述的转移载体，其特征在于所述转移载体源自以 下杆状病毒表达体系的任一种："Bac-to-Bac?"（invitrogen?)、"BacPAK?"（Clontech?)、 "FlashBAC?" (Oxford Expression Technologies?)、"BacuVance?'，(GenScript?)、 "Bac-N-Blue DNA?'' (invitrogen?)、"BaculoDirect?" (invitrogen?)、"BacVcctor?" 1000、2000、3000 ( povagen? )、"DiamondBac?"（ Sigma-Aldrich? )或"BaculoGold?"（BDb iosciences?)〇
[0033] 16.适用于生成根据第1-15项中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体的克隆 载体，包括用于高于内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-I和/或其片段的 序列，其进一步适用于细菌复制。
[0034] 17.根据第16项所述的克隆载体，还包括至少一个重组同源区域（hr)，该至少一 个重组同源区域（h