一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及耐盐植物育种技术领域，具体涉及一种筛选蒲公英耐盐突变体的方 法。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化是影响农业生产的主要胁迫因子。我国的盐渍土近1亿公顷，且盐渍 化和次生盐渍化不断扩大，为了确保人类可持续发展，必须探索有效治理和利用的方法。传 统治理办法耗费了大量的资金和水资源，且收效甚微。多年实践证明，种植耐盐植物是盐碱 地改良的生物学措施之一，是盐碱地改良利用技术中最经济、有效和可持续的方法，越来越 受到人们的重视。但耐盐植物资源、品种短缺，严重制约了生物学技术改良利用盐碱地的有 效性，因此，耐盐植物育种技术研宄得到较快发展。目前，耐盐植物育种的方法有选择育种、 杂交育种、基因工程育种、细胞工程育种、诱变育种等。应用较为广泛的是细胞工程育种， 通过充分利用离体培养过程中广泛的体细胞变异筛选获得突变体。诱变育种学是近40年 来兴起的一门现代育种技术，与离体培养相结合能丰富突变类型，提高突变频率和育种效 率。在离体条件下，利用诱变技术获得耐盐突变体的方法已经在大麦、小麦、水稻、小黑麦、 甘薯、枸杞、甜橙、河北杨、猕猴桃和杜鹃等十几种植物上得到了应用。其中发明专利《一种 筛选甘薯耐盐突变体的方法》公开了一种利用 6tlCo Y~射线辐射胚性悬浮细胞后经离体培 养获得了甘薯耐盐突变体。
[0003] 蒲公英为菊科蒲公英属多年草本植物，集食用、药用、绿化美化环境为一体的多功 能型植物，由于它是常异花授粉植物，种性不纯，而且它的花丝与花柱的周围连接，形成一 个管状体，杂交去雄时易损伤雌性部分，杂交育种不易成功。中国科学院植物研宄所开展了 药蒲公英耐盐突变体的筛选工作，发明专利《一种筛选耐盐药蒲公英的方法及其专用引物》 公开了耐盐药蒲公英体细胞变异筛选方法和耐盐检测专用引物；张新果等在论文《药蒲公 英耐I. 5% NaCl变异体的筛选及特性分析》报道了以药蒲公英叶片为外植体诱导的愈伤组 织为材料，采用NaCl溶液作为耐盐鉴定介质（压力选择剂），耐盐经3个月继代筛选获得耐 1. 5 % NaCl的愈伤组织，耐盐愈伤组织经4个月的分化培养和生根培养，通过逐步递升浓度 的方法来完成变异体的耐盐鉴定，获得了耐I. 5% NaCl的药蒲公英再生植株。
[0004] 综上所述，蒲公英耐盐突变体的筛选主要采用体细胞无性变异获得，变异体的耐 盐鉴定主要采用NaCl水溶液；目前利用诱变育种技术和离体培养相结合筛选耐盐突变体 的研宄虽然已应用于多种植物的耐盐育种，但在蒲公英耐盐突变体筛选研宄重中尚未见报 道。为了选育出更适合滨海盐碱区种植的蒲公英品种，本发明以营养体较大、产量高、耐盐 性差的一种蒲公英为材料，在建立了该蒲公英叶片离体培养高频再生技术体系的基础上， 利用EMS诱变处理愈伤组织，结合NaCl胁迫离体筛选方法获得蒲公英耐盐突变体，然后通 过盐碱原土鉴定法对突变体进耐盐鉴定，获得蒲公英耐盐突变体。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法，通过EMS诱变处理叶 片愈伤组织、NaCl间断反复胁迫离体筛选和盐碱原土鉴定相结合，筛选获得蒲公英耐盐突 变体的方法。
[0006] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0007] 一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)无菌苗培养
[0009] 挑选饱满种子用75%的乙醇处理30~50s，再用无菌水冲洗3~4次，用0. 1 %升 汞浸泡10~15min，然后用无菌水冲洗3~4次，接种到含有7g/L琼脂粉、10g/L蔗糖、pH 值5. 7~6. 0的MS培养基中，在室温为21~23°C，暗培养30d后获得无菌苗；
[0010] 2)愈伤组织诱导
[0011] 取无菌苗的叶片，切成〇. 5 X 0. 5cm大小的方块，接种到诱导培养基中，35~40d获 得胚性愈伤组织；
[0012] 3) EMS诱变处理和NaCl胁迫筛选
[0013] 将胚性愈伤组织接种在含有0.4 %浓度EMS的液体分化培养基中，进行震荡培养 2h，用无菌水冲洗干净，转至含有300mmol/L NaCl的固体分化培养基中，培养28d后，转至 不含NaCl的相同培养基中21d，交替进行，重复2次，选择高3~4cm的小苗，转移到含有 300mmol/LNaCl的MS培养基中，再次进行耐盐筛选，21d后将生长正常的小苗接种到生根培 养基中，7~10天完成生根，获得耐盐试管苗；
[0014] 4)耐盐植株获得
[0015] 将耐盐试管苗先进行闭瓶炼苗7-15d，而后开瓶炼苗5-10d，移栽至基质为1:1的 蛭石和河沙混合物中，使其成活，20-30d后，再移栽到温室大棚的土壤中。
[0016]5)耐盐植株的鉴定
[0017] 利用土壤全盐含量0. 6%左右的盐碱原土盆栽法对获得的耐盐植株进行耐盐性鉴 定，以未经诱变和NaCl筛选的再生植株作对照，筛选出成活好，长势优，各项生长指标明显 优于对照的耐盐植株。
[0018] 本发明所述的诱导培养基为含0. 5mg/L 6~节氨基嗓呤（6~BA)、0. 2mg/L二氯 本氧乙酸（2, 4~D)、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培养基。
[0019] 本发明所述的液体分化培养基为含lmg/L激动素（KT)、0. 3mg/L萘乙酸（NAA)、 30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培养基；固体分化培养基为含lmg/L激动素（KT)、0. 3mg/ L萘乙酸（NAA)、7g/L琼脂粉、30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培养基。
[0020] 本发明所述的生根培养基为含有0. 5mg/L萘乙酸（NAA)、7g/L琼脂粉、30g/L蔗糖、 pH值5. 7~6.0的MS培养基。
[0021] 步骤⑵培养条件和步骤⑶分化培养条件为：温度为21~23°C，每天光照时间 为12~16小时，光照设备为白炽灯管，光照强度为20001UX。
[0022] 步骤（3)中所述的震荡培养的条件为23°C恒温下，转速70r/min，光照强度 20001ux〇
[0023] 步骤（4)所述的炼苗条件为：自然光照、温度21-23°C、空气湿度为80~85%。
[0024] 本发明通过EMS诱变处理叶片愈伤组织、NaCl间断反复胁迫筛选和滨海盐碱原 土鉴定相结合，获得的蒲公英耐盐突变体，能够在土壤全盐含量〇. 6%左右的土壤中正常生 长，且叶长、叶宽比对照增加8~10%和5%~8%。
[0025] 依照以上技术方案，本发明只需要260~280d就能筛选出能够适应土壤全盐含量 0. 6~0. 8%土壤的蒲公英耐盐突变体，具有操作简单，效果好，效率高，加速了蒲公英耐盐 育种的进程，应用前景非常广泛。
[0026]与蒲公英耐盐突变体筛选现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0027] 1)利用EMS诱变处理与NaCl间断反复胁迫离体筛选相结合，筛选耐盐突变体，变 异率高，经历时间短，获得的突变体稳定。
[0028] 2)利用盐碱原土鉴定法对变异植株进行耐盐性鉴定，比水培、沙培等方法更切合 实际，鉴定结果也更加准确，为耐盐突变体鉴定最直接最有效的鉴定方法。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0030] 实施例1蒲公英耐盐突变体的筛选
[0031] 本实施例培养基配置：
[0032] 诱导培养基：含0?5mg/L 6~节氨基