冷冻保存骨组织的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及冷冻保存骨组织的方法。

背景技术：

1、虽然采用人造骨骼能够快速解决骨组织缺损及防止因骨癌等因素回植造成的复发等问题，但人造骨骼材料的价格远超患者经济承受范围，同时无法避免患者因接受人造骨骼移植后出现“物非原主”导致的心理焦虑和不可预期的心理压力。从提高患者康复效果的角度分析，患者仍然希望使用符合手术条件的自体骨组织，从临床治疗效果分析，使用自体骨组织能够有效提高并保持患者接受手术后的骨骨窗愈合速度，有效降低异体或人造骨引发的排异反应，提升与患者手术沟通效果进而提高治疗成功率。因此，目前大多数医务工作者和患者均倾向于使用自体来源的骨材料用于手术后对组织缺损部位进行回植修复。

2、但是目前报道的骨组织保存技术由于缺乏完整的操作流程，缺乏骨组织在处理阶段采用不同消毒药品处理样本后对其质量影响的相关数据。目前常使用的骨组织保存方法分别为湿法保存、低温保存和常温保存，湿法保存如上所述普遍存在脱钙问题，保存过程中难以维持钙平衡，无法保证骨组织经过长期保存后的物理特性。低温保存法采用-80℃甚至-196℃深低温冻存，能够较好保持骨组织活性，然而回植前复苏和水合过程一旦操作不当，极易损伤骨组织物理学特性，造成骨组织材料崩裂等现象，且复苏和水合步骤繁琐，容易引起骨组织材料污染。常温保存适用于保存过程中对脱钙或脱蛋白要求略低的骨组织材料，在保存过程中仍然存在脱钙和物理特性下降等现象。

技术实现思路

1、本发明所提供的骨组织的方法采用覆膜真空联合深低温保存技术，结合梯度降温冻存技术，通过真空和深低温外界条件，将颅骨组织细胞代谢水平降低至能够维持其活力的最低水平，采用适宜的梯度降温程序，最大程度保持颅骨组织保存过程中的物理特性，从而提高保存时间和质量。

2、具体地，本发明提供了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种冷冻保存骨组织的方法，所述方法包括以下步骤：

4、1)收集骨组织并放置于充满保存液的保存装置中；

5、2)排空空气；

6、3)以1℃/min匀速降至-20℃，再以10℃/min快速降至-80℃，最后以25℃/min降至-196℃。

7、优选地，所述步骤1)中需要确保保存液可以浸润骨组织表面；更优选地，可以根据v＝h*s*2计算保存液的加注量(v:保存液体积；h：保存液在颅骨表面形成的凝胶厚度，一般为2-3mm；s:颅骨骨瓣表面积，手术行骨瓣减压术按照标准表面积取骨)。

8、进一步地，所述骨组织经以上步骤处理后置于液氮中进行长期保存。

9、优选地，所述骨组织是经过清洗、打磨、灭菌、润洗处理的。

10、更优选地，所述清洗使用的试剂是生理盐水和/或清洗液，所述清洗液中包含卡迪姆碘和微晶纤维素。

11、优选地，所述清洗液中的卡迪姆碘的浓度为0.01％-0.05％。

12、优选地，所述清洗液中的微晶纤维素的浓度为0.01％-0.02％。

13、优选地，所述灭菌的方式是辐照灭菌。

14、如本发明所述术语“辐照灭菌”、“辐照除菌”是指利用电离辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的射线类型包括α射线、β射线、x射线和γ射线；其中，α射线和β射线是粒子束，x射线和γ射线是电磁波。

15、优选地，本发明所述辐照灭菌使用x射线。

16、优选地，所述辐照灭菌的剂量可以是20-50gy，具体地包括20gy、25gy、30gy、35gy、40gy、45gy、50gy。

17、优选地，所述辐照灭菌的剂量是25gy。

18、本发明所述gy即“gray”的缩写，是物理量“电离辐射能量吸收剂量”的标准单位。gray可译作“戈瑞”、“戈雷”、“格雷”，有时简称“戈”，在本发明中以上概念皆代表相同含义，可互换使用。

19、优选地，所述润洗是指使用保存液清洗骨组织。

20、更优选地，取润洗所使用的保存液进行检测，所述检测包括真菌、细菌、内毒素和支原体等检测项目。检测合格则可以进入下一个保存处理步骤，检测不合格的骨组织可再次进行辐照灭菌。

21、具体地，所述检测包括采用培养法进行无菌检测，采用鲎试剂进行内毒素定量检测。

22、最优选地，所述骨组织经过以下预处理：打磨去除骨组织材料表面毛刺，经生理盐水和清洗液反复清洗残留的血渍和骨粉，尽可能去除残留血块和组织碎屑；使用含有0.01％-0.5％的卡迪姆碘和0.01％-0.02％的微晶纤维素的清洗液清洗骨组织后通过辐照除菌。

23、优选地，所述保存液中含有卡迪姆碘、微晶纤维素、人血白蛋白、磷酸缓冲溶液、氯化钙和氯化钾。

24、优选地，所述保存液中含有0.01％-0.05％卡迪姆碘、0.01％-0.02％微晶纤维素、7％人血白蛋白、0.02％磷酸缓冲溶液、0.02％-0.04％氯化钙和0.01％-0.02％氯化钾。

25、最优选地，所述保存液中含有0.05％卡迪姆碘、0.02％微晶纤维素、7％人血白蛋白、0.02％磷酸缓冲溶液、0.04％氯化钙和0.01％氯化钾。

26、优选地，所述保存液的ph值是7.0-7.2。

27、优选地，所述保存装置包括保存袋、保存盒、保存管等任意类型的容器。优选地，所述保存装置的材质可以是聚酰亚胺(pi)。在本发明的具体实施例中所使用的保存装置是保存袋。

28、本发明所述“骨组织”可以来自于任何动物包括但不限于人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫等。所述骨组织的来源可以是颅骨、躯干骨和四肢骨。

29、优选地，所述骨组织来自于人。

30、最优选地，所述骨组织是颅骨组织。

31、如本发明所述术语“卡地姆碘(cadexomer iodine)”是一种外用杀菌剂，是碘和卡地姆的络合物，含碘浓度0.9％。

32、如本发明所述术语“微晶纤维素”，简称mcc(microcrystalline cellulose)，主要成分为以β-1,4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质，是天然纤维素经稀酸水解至极限聚合度的可自由流动的极细微的短棒状或粉末状多孔状颗粒，组成的白色、无臭、无味的结晶粉末。

33、在本发明具体实施例中通过真空仪排空空气，通过程控降温仪控制降温程序。具体是，采用真空仪从保存装置(保存袋)真空排气导管排出剩余气体，真空过程遵循少量多次，确保保存装置(保存袋)紧密贴合颅骨组织表面，完成真空排气后，密封排气导管管口，将保存装置(保存袋)置于程控降温仪，后按照本发明所提供的降温程序降温。

34、另一方面，本发明提供了一种保存液，所述保存液中含有卡迪姆碘、微晶纤维素、人血白蛋白、磷酸缓冲溶液、氯化钙和氯化钾。

35、优选地，所述保存液中含有0.01％-0.05％卡迪姆碘、0.01％-0.02％微晶纤维素、7％人血白蛋白、0.02％磷酸缓冲溶液、0.02％-0.04％氯化钙和0.01％-0.02％氯化钾。

36、最优选地，所述保存液中含有0.05％卡迪姆碘、0.02％微晶纤维素、7％人血白蛋白、0.02％磷酸缓冲溶液、0.04％氯化钙和0.01％氯化钾。

37、优选地，所述保存液的ph值是7.0-7.2。

38、另一方面，本发明还提供了前述保存液在在保存骨组织中的应用。

39、本发明所述“骨组织”可以来自于任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。

40、优选地，所述骨组织的来源包括但不限于颅骨、躯干骨和四肢骨。

41、优选地，所述骨组织来自于人。

42、最优选地，所述骨组织是颅骨组织。

43、在一种具体地实施例中，所述骨组织是自体组织，也即，将取自于患者自身的骨组织移植给患者本人。

44、另一方面，本发明提供给了经前述方法保存的骨组织以及其在骨移植中的应用。同时提供给了包含前述方法保存的骨组织和保存液所组成的组合物，所述组合物中还可以包括保存装置。

45、具体地，所述骨组织长期保存仍维持高质量的物理特性，脱钙率低。

46、相比于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：

47、本发明所提供的保存方法是利用保存液中微晶纤维素在真空作用下使骨组织表面形成极薄的覆盖凝胶，替代直接冻干技术，结合程序降温原理，使颅骨组织逐渐适应深低温环境的保存条件，最大限度降低冻存过程中对颅骨组织物理特性的不利影响。