一种茶树组培快繁体系的建立方法与流程

本发明属于茶树繁殖技术领域，尤其涉及一种茶树组培快繁体系的建立方法。

背景技术：

茶树属于多年生木本植物，其生育周期长、自交亲和性低、花期短等原因使得常规的茶树育种需要20-25年，育苗周期长，繁殖系数小，种质易退化等因素的制约。

综上所述，现有技术存在的问题是：茶树因自身携带较多内生菌且多酚含量高，在试验过程中会出现外植体褐化、污染等问题；导致培养周期长，生根较难，大田栽培成活率低。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种茶树组培快繁体系的建立方法。

本发明是这样实现的，一种茶树组培快繁体系的建立方法，所述茶树组培快繁体系的建立方法包括以下步骤：

外植体选择，3-5月期间采自温室带有饱满腋芽的当年生半木质嫩枝；

初代培养：陕茶1号的初代培养最佳培养基为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+ga33.0mg/l+pvp4.0mg/l；‘安吉黄茶’最佳培养基为ms+6-ba2.0mg/l+iba0.1mg/l+ga33.0mg/l+pvp4.0mg/l；

继代培养：‘陕茶1号’继代培养的最佳培养基为ms+iba0.1mg/l+6-ba3.0mg/l+ga31.0mg/l。‘安吉黄茶’：ms+tdz0.02mg/l+iba0.1mg/l

继代中的激素tdz虽然增值率很高，但长时间使用不利于茶苗伸长，所以要将继代4～5次的组培苗转到壮苗培养基中培养；

壮苗培养：陕茶1号’继代苗转至ms+naa0.1mg/l+6-ba1mg/l+ga31.0mg/l；‘安吉黄茶’转至ms+naa0.1mg/l+tdz0.01mg/l的壮苗培养基培养20天有助于茶苗的叶片展开与伸长；

生根培养：‘陕茶1号’生根配方为500mg/liba浸泡茶苗基部5min。‘安吉黄茶’生根培养基为1/2ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l+iba0.1mg/l。

进一步，所述步骤一中用洗洁精清洗表面，用自来水冲洗5小时；在无菌室内用75％酒精浸没20-40秒；用35％的次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟；用无菌水冲洗4-5次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。

进一步，所述步骤二中无菌室内消毒具体包括：

用紫外灯照射30-45分钟；

地面用低浓度的来苏尔溶液消毒；

超净工作台消毒，开启无菌风开关；

用75％的酒精棉球擦净工作台，接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀先浸泡在75％的酒精溶液中。

进一步，所述步骤三中培养；中的植物生长调节剂包括：称取6-ba，溶于hcl中，用蒸馏水容，使最终浓度为0.1mg/l；tdz和naa分别溶于naoh中，用蒸馏水定容，使最终浓度分别0.01mg/l和0.1mg/l；iba、ga3溶于酒精中，蒸馏水定容，使终浓度分别为0.1mg/l、1mg/l；配制好的植物生长调节剂存于植物棕色瓶中，4℃冰箱保存。

进一步，所述步骤三中植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌包括：

(1)量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，加入4.43gms干粉，30g蔗糖，7～8g琼脂，4gpvpp，依次加入植物激素；

(2)调节培养基的ph值，用ph计或ph试纸测定；

培养基的ph按照培养材料分别用1mol/lnaoh溶液、1mol/lhcl溶液来调节所配制培养基的ph值；

(3)灭菌；加热至沸腾，将配制并加热好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用封口膜封口，注明标签；然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌；，采用全自动高压灭菌锅，待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖，在98kpa、121.3℃下，灭菌21min；

(4)分装；灭菌后取出培养基，在超净工作台中向培养基中依次加入经细菌过滤器过滤后的植物激素，混匀后分装备用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述茶树组培快繁体系的建立方法繁殖的茶树。

本发明的优点及积极效果为：采用稳定的培养环境使得外植体按集合级数增殖增并可以周年生产；可用于形成工厂化生产，按一定工艺流程规范化程序化生产的；具有繁殖速度快、整齐、一致、无虫少病、生长周期短、遗传性稳定的特点。

本发明带来的直接技术效果就是建立起了茶树陕茶1号、安吉黄茶的组织离体培养体系。之前没有人建立这两个品种的离体培养体系。

附图说明

图1是本发明实施例提供的茶树组培快繁体系的建立方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的茶树组培快繁体系的建立方法包括以下步骤外植体选择，3-5月期间采自温室带有饱满腋芽的当年生半木质嫩枝；

初代培养：陕茶1号的初代培养最佳培养基为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+ga33.0mg/l+pvp4.0mg/l；‘安吉黄茶’最佳培养基为ms+6-ba2.0mg/l+iba0.1mg/l+ga33.0mg/l+pvp4.0mg/l；

继代培养：‘陕茶1号’继代培养的最佳培养基为ms+iba0.1mg/l+6-ba3.0mg/l+ga31.0mg/l。‘安吉黄茶’：ms+tdz0.02mg/l+iba0.1mg/l

继代中的激素tdz虽然增值率很高，但长时间使用不利于茶苗伸长，所以要将继代4～5次的组培苗转到壮苗培养基中培养；

壮苗培养：‘陕茶1号’继代苗转至ms+naa0.1mg/l+6-ba1mg/l+ga31.0mg/l；‘安吉黄茶’转至ms+naa0.1mg/l+tdz0.01mg/l的壮苗培养基培养20天有助于茶苗的叶片展开与伸长；

生根培养：‘陕茶1号’生根配方为1000mg/liba浸泡茶苗基部1min后接种至不添加任何植物激素的1/2ms培养基上诱导诱导生根。‘安吉黄茶’生根培养基为1/2ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l+iba0.1mg/l。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的茶树组培快繁体系的建立方法包括以下步骤：

s101：取从温室剪下的茶树枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用洗洁精清洗表面，再用自来水冲洗5小时，然后在无菌室内用75％酒精浸没20-40秒用35％的次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗4-5次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用；

s102：先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作；超净工作台消毒，开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用75％的酒精棉球擦净工作台，接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在75％的酒精溶液中；

s103：在25℃光照13小时/天光强1000lux下培养；

s104：初代培养，茶树离体腋芽最佳初代的初代培养基为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+ga33.0mg/l+pvp4mg/l；(陕茶1号)和ms+6-ba2.0mg/l+iba0.1mg/l+3.0mg/lga3+pvp4mg/l；(‘安吉黄茶)；

s105：继代培养，继代培养的最佳培养基为ms+0.1ibamg/l+6-ba3mg/l+ga31.0mg/l(‘陕茶1号’)；：或ms+tdz0.02mg/l+iba0.1mg/l(安吉黄茶)；

s106：壮苗培养，壮苗培养：继代苗转至ms+naa0.1mg/l+6-ba1mg/l+ga31.0mg/l(陕茶1号’)；或‘’转至ms+naa0.1mg/l+tdz0.01mg/l(安吉黄茶)的壮苗培养基培养20天有助于茶苗的叶片展开与伸长；

s107：诱导生根，用1000mg/liba浸泡，茶苗基部1min后接种至不添加任何植物激素的1/2ms空白培养基中(‘陕茶1号’)。或在1/2ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l+iba0.1mg/l的培养基中诱导生根(‘安吉黄茶’)；

s108：试管苗从琼脂培养基中移出时要用长镊子小心取出，清洗干净根部，直接移栽或使用0.1％～0.3％的高锰酸钾或多菌灵等杀菌剂溶液中清洗，然后用清水清洗后移入苗床或盆钵；炼苗在塑料薄膜温室内或遮阴网室内进行。

下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。

一、仪器设备和试剂：

超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水、枪型镊子、量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、95％乙醇、75％酒精、纱布、35％次氯酸钠、酒精喷壶。

二、实验材料：茶树枝条。

三、方法和步骤：

1、外植体灭菌

取从温室剪下的茶树枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂(洗洁精)清洗表面，再用自来水冲洗5小时，然后在无菌室(超净工作台)内用75％酒精浸没20-40秒钟(根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间)用35％的次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗4-5次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。

2、接种

先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。超净工作台消毒，开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用75％的酒精棉球擦净工作台。接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在75％的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边封口，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。

3、培养条件：25℃光照13小时/天光强1000lux。

4、初代培养，茶树离体腋芽最佳初代的初代培养基为ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+ga33.0mg/l+pvp4mg/l；(陕茶1号)和ms+6-ba2.0mg/l+iba0.1mg/l+3.0mg/lga3+pvp4mg/l；(‘安吉黄茶)；

继代培养，继代培养的最佳培养基为ms+0.1ibamg/l+6-ba3mg/l+ga31.0mg/l(‘陕茶1号’)；或ms+tdz0.02mg/l+iba0.1mg/l(安吉黄茶)；

壮苗培养，壮苗培养：继代苗转至ms+naa0.1mg/l+6-ba1mg/l+ga31.0mg/l(陕茶1号’)；或转至ms+naa0.1mg/l+tdz0.01mg/l(安吉黄茶)的壮苗培养基培养20天有助于茶苗的叶片展开与伸长；

5、诱导生根，用1000mg/liba浸泡，茶苗基部1min后接种至不添加任何植物激素的1/2ms空白培养基中(‘陕茶1号’)。或在1/2ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l+iba0.1mg/l的培养基中诱导生根(‘安吉黄茶’)。

6、试管苗移栽，试管苗从琼脂培养基中移出时要用长镊子小心取出，彻底清洗干净根部(因为残留的蔗糖和营养会成为潜在的致病微生物的生长培养基，洗不净容易引起移栽苗烂根死亡)，并且避免损坏根系；之后直接移栽或使用0.1％～0.3％的高锰酸钾或多菌灵等杀菌剂溶液中清洗，然后用清水清洗后移入苗床或盆钵，也可用水清洗后用多菌灵溶液浸泡10～30分钟后移栽，栽后淋足定根水。炼苗在塑料薄膜(或玻璃)温室内或遮阴网室内进行，使用温室或温棚时应注意设置通风口，防止浇水后高温引起萎蔫及高湿引起烂苗；生长基质应当具有适合的ph值、多空隙、良好的排水和通气性能，如蛭石、珍珠岩、椰糠、沙、土等及按适当比例的混和物。

培养条件中的植物生长调节剂配置包括：

称取适量的6-ba，溶于hcl中，用蒸馏水容，使最终浓度为0.1mg/l。tdz和naa分别溶于naoh中，用蒸馏水定容，使最终浓度分别0.01mg/l和0.1mg/l。iba、ga3溶于酒精中，蒸馏水定容，使终浓度分别为0.1mg/l、1mg/l。配制好的植物生长调节剂存于植物棕色瓶中，4℃冰箱保存。

植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌包括：

(1)量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基，先量取约700ml体积的水。加入4.43gms干粉，30g蔗糖，7～8g琼脂，4gpvpp。

(2)调节培养基的ph值，用ph计或ph试纸测定

培养基的ph按照培养材料的要求分别用1mol/lnaoh溶液、1mol/lhcl溶液来调节所配制培养基的ph值，一般培养基的ph值约为5.8。

(3)灭菌；加热至沸腾片刻，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。将配制并加热好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用封口膜封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。采用全自动高压灭菌锅，待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖，在98kpa、121.3℃下，灭菌21min；

(4)分装；灭菌后取出培养基，在超净工作台中向培养基中依次加入经细菌过滤器过滤后的植物激素，混匀后分装。让培养基自然冷却凝固；最好放置1d后再使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。