鱼藤酮在抑制轮虫产卵中的用途的利记博彩app

本发明属于微藻养殖领域，尤其是微藻养殖中病虫害的防治技术。

背景技术：

微藻是一类单细胞植物，广泛存在于各类水体。微藻富含蛋白质、脂肪和碳水化合物，其代谢产物附加值高，可应用于食品，医药、保健、能源等领域。其主要特点包括具有光合效率高，生长速率快，可利用海水或碱水培养，不与农作物争水争地等。很多微藻细胞内含有大量油脂，油脂提取后经转酯化后可获得生物柴油，生物柴油是解决能源危机的一个重要途径，可用于取代目前所用的液体燃料。但是自然界很难得到大量的微藻生物量，因此如何获得大量的微藻，如何有效地规模化培养微藻是未来全球生物能源产业的一个主要突破点。

随着工业化培养规模的逐级扩大，敌害生物的控制并不能像实验室无菌环境下那样精确有效。在制约微藻大规模培养的敌害生物中，浮游动物轮虫对藻类的摄食危害最为严重。每个轮虫每天可摄食数以万计的藻细胞，当轮虫密度达到100尾/ml或更大时，即使培养液中藻细胞浓度很高，也会在短时间内被轮虫全部吃光。同时，轮虫的吞噬活动也在培养水体中形成大量的细菌-微藻絮凝体，引起水体进一步恶化，轮虫繁殖具有世代交替现象，环境条件适宜的时候进行孤雌生殖大量扩大种群数量，环境不适宜的时候迅速形成休眠卵，抵御不良环境。

一般来说，控制轮虫的方法有物理法(过滤法、紫外线照射、超声处理)、化学防治法，生物控制法等。在微藻工业化培养中，一般采用紫外法、臭氧法或5％有效氯的次氯酸钠对培养水体进行前期预消毒1-2天，然后冲洗干净加入新鲜培养液进行生产。该方法可有效清除轮虫存活个体，但对大多数轮虫休眠卵的灭活率比较低。在实施过程中一旦休眠卵残存下来，对微藻的培养仍会造成爆发性危害。过滤法仅能滤除体型较大的轮虫成体(>200μm)，对于轮虫幼体或轮虫卵难以去除，且过滤速度很慢，耗费时间长，尚不能与目前的光生物反应器结合起来用于藻的规模化培养。化学防治对轮虫确有杀灭效果，但是对于藻的生长繁殖和生理活性也会产生抑制或毒性作用，因此其应用受到相当大的局限。

鱼藤酮是一种从豆科鱼藤属植物种子、块根中发现的植物衍生物，具有广谱杀虫作用。已有研究表明其作用机理是进入虫体抑制线粒体呼吸链，导致害虫出现呼吸困难和惊厥等呼吸体统障碍，行动迟缓，麻痹而死。鱼藤酮具有环境低毒性，它比市售很多其他杀虫剂毒性要低很多，对鱼和害虫有剧毒，但是对人安全，其原因是鱼藤酮是亲脂性物质，很容易进入昆虫气管和鱼的鳃部，造成毒害，而不易通过人的皮肤进入人体，因此对人安全无害。

Agbon等研究发现鱼藤酮对臂尾属轮虫48小时内的半致死浓度为2.89ppm，此浓度虽然对藻类没有影响，但其施用浓度较高，且需要在微藻养殖的过程中，使藻液中始终保持一定浓度的鱼藤酮，未明确鱼藤酮添加的次数和频率，也就是说鱼藤酮的添加很可能是一个持续的过程，因此使轮虫的防治成本较高。更重要的是，鱼藤酮始终属于一种毒性药物，尽管对人体无害，仍会对环境中其他生物产生毒性，例如，水蚤48小时半致死浓度为1.04ppm，而利用鱼藤酮0.025mg/L就可把鱼毒死。为了避免大量毒性物质排放到自然环境中累积造成生物生态环境失衡，破坏鱼类水产养殖环境，十分有必要减少其施用的量，包括施用的频率和浓度。这对微藻的大规模养殖中的病虫害防治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种微藻大规模养殖中轮虫的防治方法，该方法更具有经济性，在一定程度上减少微藻养殖的病虫害防治成本，同时减少毒性物质在自然环境中的排放和积累。

本发明的另一目的是提供鱼藤酮在抑制轮虫产卵中的用途，该用途为鱼藤酮控制轮虫提供了一种新的思路和方法。

本发明在研究中发现，鱼藤酮对抑制轮虫的产卵率有极佳的效果，极低剂量的鱼藤酮可以大量降低轮虫的产卵率。因而本发明提出一种新的微藻养殖中轮虫防治的思路，不仅可有效减少鱼藤酮的使用量，还可以将微藻大规模培养中轮虫的爆发控制达到相当程度，保证大微藻规模培养的顺利进行。

经过研究摸索，轮虫种群的增长一般在第三天种群到达稳定期，此时轮虫抱卵率开始大量增加，轮虫卵和种群峰值具有同时出现的趋势(Edmondson 1965)。本发明的方案主要是在轮虫大量产卵之前，一次性加入低剂量的鱼藤酮试剂，从而抑制轮虫卵的产生，控制轮虫种群的数量。轮虫的抱卵率又叫怀卵率，在显微镜下可以观察轮虫体内有卵。

本发明的一种微藻养殖中轮虫的防治方法，其包括：

通过监测轮虫，在轮虫大规模产卵之前，一次性向微藻培养体系中加入鱼藤酮，使微藻培养体系中鱼藤酮的浓度达到0.5-2ppm。

所述监测是在显微镜下观察，当轮虫的抱卵率达到50％时，标志着轮虫即将进行大规模产卵。

其中，在微藻养殖过程中，通过检测微藻培养体系感染轮虫的状态，自发现存在轮虫感染情况开始至第三天，向微藻养殖培养体系中加入鱼藤酮。

经实验验证：24h内，轮虫卵(特指可发育成成虫的受精卵)的数量减少70.1％—91.9％；96h内，由于轮虫卵的数量被抑制，微藻培养体系中轮虫活体数量减少37.0％—75.6％。

其中，用到的鱼藤酮为市售鱼藤酮制剂，鱼藤酮质量百分含量7.5％，购自广州多宇生物科技有限公司。

本发明的技术效果：

本发明减少了鱼藤酮在控制微藻养殖过程中的施用量和施用频次，仅在轮虫的成虫进行大量产卵之前，向培养微藻的藻液中加入一定低剂量的鱼藤酮，利用其低剂量时对轮虫的产卵率有显著灭杀的作用，控制轮虫种群数量，使微藻免受轮虫侵害。同时实验还证明，该可抑制轮虫产卵的低浓度鱼藤酮对微藻的正常生长不产生影响。本发明适用于大规模微藻的培养，在轮虫污染早期可对轮虫的种群数量进行有效控制。特别是对于微藻的大规模水体养殖环境来说，鱼藤酮在施用浓度和频次上的减少，能大幅减少鱼藤酮随着藻液排放对环境的影响和微藻养殖的病虫害控制成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为鱼藤酮的施用浓度0-2ppm时轮虫卵数量随时间的变化情况。

图2为鱼藤酮的施用浓度0-2ppm时轮虫成虫数量随时间的变化情况。

图3为鱼藤酮的施用浓度0-15ppm时栅藻在显微镜下观察的栅藻细胞形态变化。

图4为鱼藤酮的施用浓度0-15ppm时栅藻随培养天数的生长情况。

图5为鱼藤酮的施用浓度0.5ppm时轮虫在显微镜下观察的轮虫皱缩状态。

具体实施方式

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1:低浓度鱼藤酮对轮虫成虫和轮虫卵的影响实验

在12L平板反应器培养中发现轮虫污染，在发现轮虫的第三天(抱卵率达到≥50％以上，标志着轮虫将大量产卵)，分别取100ml培养液到12个250ml三角瓶中，随机分成4组，每组3个重复。每个实验组添加不同浓度的鱼藤酮，分别为0ppm，0.5ppm，1ppm和2ppm，在20℃室温，45μmol photons·m^-2·s^-1的光照条件下振荡培养。每隔24h在每个三角瓶中取样2ml，用1％鲁戈式碘液固定，在倒置显微镜(奥林巴斯，型号BX41)下用100μL浮游动物计数框统计轮虫和轮虫卵的数量，每个样品三次重复计数。

结果如图1、2所示：在鱼藤酮浓度为0-2ppm范围内，在显微镜下观察，轮虫卵数量在24h之内迅速下降(如图1)，而轮虫成虫数量在96小时之内也产生跟随性下降，成虫数量在24h几无减少(如图2)。在96h以后，轮虫种群得到有效控制。由于虫卵的数量迅速下降，而成虫因寿命较短也开始自然死亡，从而实现藻液中轮虫数量的控制，使微藻免受轮虫爆发而受侵害。

实施例2：鱼藤酮使用对栅藻生长的影响实验

鱼藤酮对栅藻生长的影响实验：在1L柱式反应器中培养栅藻，实验分为5组，每组3个重复，每个反应器最初接种相同量的栅藻，干重为0.8克每升，培养基为BG-11。每组分别加入鱼藤酮，控制其有效浓度分别为0、1.5、3、7.5、15ppm。在20℃室温，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照条件下通气培养，通入CO₂的量为2％。每隔24h在每个柱式反应器中取样20ml，在显微镜(奥林巴斯，型号BX53)下观察栅藻活体细胞的状态以及拍照比较(如图3)。取10ml用干燥的GF/C膜过滤，测定栅藻每日干重，栅藻生长状态随培养天数变化图，如图4。结果显示，再鱼藤酮浓度为0-15ppm的范围内，对栅藻的正常生长没有影响。

实施例3

在12L平板式反应器培养栅藻过程中发现轮虫污染，培养条件为20℃室温，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照条件下通气培养，通入CO₂的量为2％，培养基为BG-11。在显微镜连续观察的第三天，此时显微镜下观察发现轮虫抱卵率≥50％，立刻一次性添加鱼藤酮至浓度为0.5ppm。经过24小时，轮虫卵的减少率为74.5％，经过96小时，轮虫成虫自然减少率达37.0％，但是轮虫大部分为皱缩状态(如图5)，摄食运动减少，此时不对微藻构成危险。相较于文献记载的48小时的半致死浓度为2.89ppm(Agbon，2004)，本实施例中鱼藤酮的使用量减少82.7％，即可达到相当的控制效果。

实施例4

在12L平板式反应器培养栅藻过程中发现轮虫污染，培养条件为20℃室温，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照条件下通气培养，通入CO₂的量为2％，培养基为BG-11。在显微镜连续观察的第三天，此时显微镜下观察发现轮虫抱卵率≥50％，立即加入鱼藤酮进行控制，一次添加鱼藤酮试剂至栅藻培养体系中，使鱼藤酮浓度为1ppm。经过24小时，轮虫卵的减少量为87.2％，经过96小时，轮虫成虫自然减少量达41.4％，但是轮虫大部分为皱缩状态，摄食运动减少，此时几乎不对微藻构成危险。相较于文献记载的48小时的半致死浓度为2.89ppm(Agbon，2004)，本实施例鱼藤酮用量减少65.4％。

实施例5

在12L平板式反应器培养栅藻过程中发现轮虫污染，培养条件为20℃室温，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照条件下通气培养，通入CO₂的量为2％，培养基为BG-11。在连续观察的第三天，轮虫产卵率显著增长之前(此时显微镜下观察发现轮虫抱卵率≥50％)，加入鱼藤酮进行控制，一次添加至栅藻培养体系中鱼藤酮浓度达2ppm。经过24小时，在显微镜下观察轮虫卵的减少率为91.9％；经过96小时，轮虫成虫自然减少率达75.6％。相较于文献记载的48小时的半致死浓度为2.89ppm(Agbon，2004)，本实施例鱼藤酮用量减少30.8％，即可达到相当的控制效果。

实施例6

在420L管道式光生物反应器培养栅藻过程中发现轮虫污染，培养条件为20℃室温，140μmol photons·m^-2·s^-1的光照条件下通气培养，控制pH在6.5-7.0，培养基为BG-11。在连续观察的第三天，轮虫产卵率显著增长之前(此时显微镜下观察发现轮虫抱卵率≥50％)，加入鱼藤酮进行控制，一次添加至栅藻培养体系中鱼藤酮浓度达2ppm。经过24小时，轮虫卵的减少率为92.3％；经过96小时，轮虫成虫的减少率为74.4％。根据文献提供量2.89ppm(Agbon，2004)，此次减少用量30.8％，达到更好的控制效果。

实施例7

在室外520L跑道池光生物反应器培养栅藻过程中发现轮虫污染，培养条件为室温，自然光照，通入CO₂量为1-2升每分钟，控制pH在6.5-7.0，培养基为BG-11。在连续观察的第三天，轮虫产卵率显著增长之前(此时显微镜下观察发现轮虫抱卵率≥50％)，加入鱼藤酮进行控制，一次添加至栅藻培养体系中鱼藤酮浓度达2ppm。经过24小时，轮虫卵的减少率为70.1％；经过96小时，轮虫成虫的减少率为63.0％。根据文献提供量2.89ppm(Agbon，2004)，此次减少用量30.8％，达到更好的控制效果。