一种简便的相思开放式瓶内扦插生根方法与流程

本发明属于植物栽培技术领域，特别涉及一种简便的相思开放式瓶内扦插生根方法。

背景技术：

无性繁殖能最大限度保持其优良母株的优良性状，利于优树优良性状的固定。扦插是木本植物重要的无性快繁方式之一。已开展了许多林木树种的扦插技术研究(孙红梅，2011；胡勐鸿等，2014；王书胜等，2015)，扦插生根机理研究则是一大热点，不定根的形成受到许多内在因子和环境因子影响的，包括光强、光质和温度，植物激素和碳水化合物等(Leakey，2004)。学者以炭化稻壳和泥炭按体积比1：1混合为扦插基质，研究欧洲云杉扦插生根过程中内源激素和酚类物质的变化(欧阳芳群等，2015)；以泥炭土和珍珠岩(1：3)为扦插基质，研究糙叶杜鹃生根过程中内源激素及营养物质的变化(赵云龙等，2013)。扦插生根机理的研究却一直没有得到很好的进展，主要原因是学者们的研究，主要是在各种不同的扦插基质上进行，如黄心土、砂石、蛭石、泥炭土等等成分复杂的物质，这些基质成分的未知性，导致了生根机理研究结果的不准确。因此，建立一种全新的扦插技术体系，对今后深入、准确地开展扦插生根机理研究具有十分重要的意义。

本课题组长期从事相思育种理论和技术方面的研究(黄烈健等，2013；胡峰等，2015；施琼等，2015；黄烈健等，2015)，建立了完善的相思扦插技术体系(易敏等，2010；易敏等，2011；易敏等，2014)，但仍以成分未知的基质进行扦插，扦插技术并未得到实质性的改变，导致对相思扦插生根机制的研究受限。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种简便的相思开放式瓶内扦插生根方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种简便的相思开放式瓶内扦插生根方法，包括如下步骤：

当年生腋芽饱满枝条为外植体，消毒，浸泡，再开放式接种至扦插基质中，培养。

所述的相思为马大杂种相思(A.mangium×A.auriculiformis)、马占相思(Acacia mangium)或大叶相思(A.auriculiformis)。

将当年生腋芽饱满枝条，洗衣粉水浸泡，刷净后流水冲洗，剪成长2.0～3.0cm带腋芽的茎段。优选取中部带叶茎段(即第3～5腋芽带叶茎段)。

所述的洗衣粉水浸泡的时间优选为10～60min；所述的流水冲洗的时间优选为1～3h。

进一步的，所述的洗衣粉水浸泡的时间为30min；所述的流水冲洗的时间为2h。

所述的消毒是以多菌灵进行消毒；

所述的多菌灵的浓度为0.2～1.0g·L^-1；消毒的时间为1～15min。

进一步的，所述的多菌灵的浓度为0.8g·L^-1；消毒的时间为3min。

所述的浸泡是用生根剂IBA浸泡；

所述的生根剂IBA的浓度优选为0.1g·L^-1～1.5g·L^-1。

所述的浸泡的时间优选为1～3h。

进一步的，所述的生根剂IBA的浓度为0.2g·L^-1～1.4g·L^-1。所述的浸泡的时间为2～3h。

进一步的，马大杂种相思的浸泡是用生根剂IBA0.4～1.0g·L^-1浸泡2～3h；更进一步的，用生根剂IBA1.0g·L^-1浸泡2h；

进一步的，马占相思的浸泡是用生根剂IBA 0.2～1.4g·L^-1浸泡2h；更进一步的，用生根剂IBA 0.6g·L^-1浸泡2h；

进一步的，大叶相思的浸泡是用生根剂IBA 0.4～1.0g·L^-1浸泡2～3h；更进一步的，用生根剂IBA 0.8g·L^-1浸泡3h；

所述的扦插基质为百菌清0.1～1.0g·L^-1+琼脂5～8g·L^-1。

进一步的，所述的扦插基质为百菌清0.2～0.8g·L^-1+琼脂5～8g·L^-1；更进一步的，所述的扦插基质为百菌清0.2g·L^-1+琼脂7g·L^-1；

所述的培养的条件为培养温度为25℃±2℃，每日光照12h，光照强度2500Lx。

本发明的机理是：本研究以马大杂种相思，马占相思、大叶相思采穗圃当年生枝条为外植体，将其扦插至装入玻璃瓶的极简化的基质中，在室内进行生根，对外植体种类及消毒方式进行研究，同时对基质中加入的抑菌剂种类和浓度进行筛选，并对促进生根的生长调节剂的种类和浓度进行筛选，获得了成分可控的扦插基质，并能在室内进行开放式扦插培养。建立的开放式扦插方法，由于基质的成分简单、可控制，为今后深入研究相思扦插生根机理创制了一个良好的技术平台，同时该扦插生根技术方法，也将为其他林木树种开展扦插生根机理研究提供很好的借鉴。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明对马大杂种相思、马占相思、大叶相思进行瓶内扦插生根研究，以建立三种相思可带菌进行培养，扦插基质简单，不需特殊培养条件的瓶内生根体系。

(2)本发明中三种相思均以百菌清为适宜的抑菌剂；以中部带叶为最佳外植体，并以多菌灵0.8g·L^-1浸泡3min对外植体进行预处理，并IBA 1.0g·L^-1处理2h(马大杂种相思)、IBA0.6g·L^-1处理2h(马占相思)、IBA 0.8g·L^-1处理3h(大叶相思)，在开放的实验台上接种至扦插基质中，生根率均高于90％，分别为：100％，94.33％，100％。

(3)本发明在扦插基中加入抑菌剂，不使用高温高压灭菌、超净工作台，利用植物的光自养能力在无营养元素的基质上进行扦插，获得了较高的生根率，建立了三种相思开放式瓶内生根技术体系。

附图说明

图1是实施例1中的抑菌剂百菌清0.2g·L^-1的情况。

图2是实施例1中的中部带叶茎段外植体，多菌灵消毒3min的情况。

图3是实施例1中的生根剂IBA 1.0g·L^-1处理2h对生根的影响。

图4是实施例2中的抑菌剂百菌清0.2g·L^-1的情况。

图5是实施例2中的中部带叶茎段外植体，多菌灵消毒3min的情况。

图6是实施例2中的生根剂IBA 0.6g·L^-1处理2h对生根的影响。

图7是实施例3中的抑菌剂百菌清0.2g·L^-1的情况。

图8是实施例3中的中部带叶茎段外植体，多菌灵消毒3min的情况。

图9是实施例3中的生根剂IBA0.8g·L^-1，处理3h对生根的影响。

图10是生长调节剂浓度及处理时间对马大杂种相思扦插生根率的影响。

图11是生长调节剂浓度及处理时间对马占种相思扦插生根率的影响。

图12是生长调节剂浓度及处理时间对大叶相思扦插生根率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1材料方法

1.1材料

从中国林业科学研究院热带林业研究所马大杂种相思16年生试验林中选取优良单株，在优良单株上采集枝条，先通过扦插繁殖，建立采穗圃，从一年生的采穗圃中采集腋芽饱满的枝条为研究材料。

1.2方法

1.2.1抑菌剂种类及浓度对马大杂种相思扦插的影响

于8月剪取马大杂种相思采穗圃的当年生腋芽饱满枝条，将采集的枝条剪去叶片，洗衣粉水浸泡30min，刷净后流水冲洗2h，剪成长2.0～3.0cm带腋芽的茎段。扦插于加入抑菌剂：百菌清或多菌灵的培养基中，两种抑菌剂分别设4个浓度：0.2，0.4，0.6，0.8g·L^-1。每个处理接种24个茎段，重复3次。

1.2.2外植体类型和消毒方式对马大杂种相思扦插的影响

将马大杂种相思当年生腋芽饱满枝条的第1～2腋芽茎段(上段)、第3～5腋芽茎段(中段)、分别剪成带叶、不带叶两种类型的长2.0～3.0cm带腋芽茎段，扦插于培养基中。每个处理接种21个茎段，重复3次。

1.2.3IBA、NAA、ABT浓度及处理时间对马大杂种相思扦插的影响

马大杂种相思：以IBA、NAA、ABT浓度0.4，0.6，0.8，1.0g·L^-1，处理时间分别为：2，3h。每个处理接种24个茎段，重复3次。

1.3培养条件

培养基中添加琼脂7g·L^-1，控制pH值为6.0(抑菌剂加入前测定)，在实验室开放的实验台上接种，培养温度为25℃±2℃，每日光照12h，光照强度2500Lx。培养45d后统计褐化率、污染率、存活率、生根率。

1.4数据处理

使用Excel，SPSS19.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性。

污染率％＝污染数÷接种数×100％........................................①

褐化率％＝褐化数÷接种数×100％..................................②

存活率％＝存活数÷接种数×100％....................................③

总生根率％＝生根的外植体数÷总接种外植体数×100％.......................④

存活生根率％＝生根的外植体数÷存活的外植体数×100％......................⑤

其中，①+②+③＝100％。

2结果与分析

2.1抑菌剂种类及浓度对马大杂种相思外植体的影响

从表1可以看出，2种抑菌剂对马大杂种相思外植体的影响，总体来说，多菌灵的污染率较百菌清的高，多菌灵不适宜作为马大杂种相思扦插生根的抑菌剂。

而百菌清对马大杂种相思外植体的影响，随着浓度的升高，褐化率增加，污染率的变化不太明显(马大杂种相思，在百菌清0.8g·L^-1时，污染率较为严重，为20.83％)，外植体存活率也显著降低。

综合来看，百菌清浓度为0.2g·L^-1时，马大杂种相思的外植体存活率最高，为80.55％(图1)。

表1抑菌剂种类和浓度对3种相思扦插的影响^①

①同列数据小写字母不同表示LSD检验差异显著(P<0.05)，下同。

2.2外植体类型和消毒方式对马大杂种相思外植体的影响

从表2可以看出，马大杂种相思不同外植体类型，采用不同的消毒方式，其褐化率、污染率和存活率均有显著性差异。其中，上部带叶、中部不带叶茎段，无论采用哪种消毒方式，它们的褐化率均显著高于中部带叶的茎段；而存活率则显著低于中部带叶的茎段。因此，中部带叶的茎段是马大杂种相思适宜的外植体。

马大杂种相思的中部带叶茎段，采用不同方式消毒，褐化率、污染率和存活率部分有显著差异，表现为多菌灵处理3min的效果最好(图2)，存活率为96.83％。

表2外植体类型及消毒方式对3种相思扦插的影响^①

2.3生长调节剂浓度及处理时间对马大杂种相思扦插的影响

马大杂种相思接种于培养基后30d左右开始生根，40d左右根伸长至4cm左右。IBA 1.0g·L^-1处理2h时，开放扦插生根率最高，为100％(图3、图10)。三种生长调节剂处理中，IBA处理的生根效果最优，其次是ABT。IBA处理2h的效果优于3h的(表3)。IBA处理时间为2h时随着IBA浓度的增加，生根率持续上升，直至IBA 1.0g·L^-1时生根率达100％；处理时间为3h时生根率随着IBA浓度上升呈现先上升后下降的趋势，0.8g·L^-1对应的生根率为56.03％(显著低于此浓度2h的生根率)，且IBA浓度继续增加，生根率急剧下降，IBA1.0g·L^-1时生根率仅为13.90％。NAA处理2h，3h生根率均随着NAA浓度的增加呈现上升趋势，但不同处理时间和浓度对应的生根率并无显著差异。ABT处理2h时生根率随浓度增加不断下降，3h时生根率随着浓度的增加呈现先上升后下降趋势。

表3生长调节剂浓度及处理时间对马大杂种相思扦插生根的影响^①

实施例2

1材料方法

1.1材料

从中国林业科学研究院热带林业研究所马占相思16年生试验林中选取优良单株，在优良单株上采集枝条，先通过扦插繁殖，建立采穗圃，从一年生的采穗圃中采集腋芽饱满的枝条为研究材料。

1.2方法

1.2.1抑菌剂种类及浓度对马占相思扦插的影响

于8月剪取马占相思采穗圃的当年生腋芽饱满枝条，将采集的枝条剪去叶片，洗衣粉水浸泡30min，刷净后流水冲洗2h，剪成长2.0～3.0cm带腋芽的茎段。扦插于加入抑菌剂：百菌清或多菌灵的培养基中，两种抑菌剂分别设4个浓度：0.2，0.4，0.6，0.8g·L^-1。每个处理接种24个茎段，重复3次。

1.2.2外植体类型和消毒方式对马占相思扦插的影响

将马占相思当年生腋芽饱满枝条的第1～2腋芽茎段(上段)、第3～5腋芽茎段(中段)、分别剪成带叶、不带叶两种类型的长2.0～3.0cm带腋芽茎段，扦插于培养基中。每个处理接种21个茎段，重复3次。

1.2.3IBA、NAA、ABT浓度及处理时间对马占相思扦插的影响

马占相思：以IBA浓度0.2，0.6，1.0，1.4g·L^-1，处理时间为：2h。每个处理接种24个茎段，重复3次。

1.3培养条件

培养基中添加琼脂7g·L^-1，控制pH值为6.0(抑菌剂加入前测定)，在实验室开放的实验台上接种，培养温度为25℃±2℃，每日光照12h，光照强度2500Lx。培养45d后统计褐化率、污染率、存活率、生根率。

1.4数据处理

使用Excel，SPSS19.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性。

污染率％＝污染数÷接种数×100％...........................................①

褐化率％＝褐化数÷接种数×100％........................................②

存活率％＝存活数÷接种数×100％............................................③

总生根率％＝生根的外植体数÷总接种外植体数×100％........................④

存活生根率％＝生根的外植体数÷存活的外植体数×100％......................⑤

其中，①+②+③＝100％。

2结果与分析

2.1抑菌剂种类及浓度对马占相思外植体的影响

从表1可以看出，2种抑菌剂对马占相思外植体的影响，总体来说，多菌灵的污染率较百菌清的高，多菌灵不适宜作为马占相思扦插生根的抑菌剂。

而百菌清对马占相思外植体的影响，随着浓度的升高，褐化率增加，污染率的变化不太明显，外植体存活率也显著降低。

综合来看，百菌清浓度为0.2g·L^-1时，马占相思的外植体存活率最高，为86.11％(图4)。

2.2外植体类型和消毒方式对马占相思外植体的影响

从表2可以看出，马占相思不同外植体类型，采用不同的消毒方式，其褐化率、污染率和存活率均有显著性差异。其中，上部带叶、中部不带叶茎段，无论采用哪种消毒方式，它们的褐化率均显著高于中部带叶的茎段；而存活率则显著低于中部带叶的茎段。因此，中部带叶的茎段是马占相思适宜的外植体。

马占相思的中部带叶茎段，采用不同方式消毒，褐化率、污染率和存活率部分有显著差异，表现为多菌灵处理3min的效果最好(图5)，存活率为90.48％。

2.3生长调节剂浓度及处理时间对马占相思扦插的影响

马占相思扦插于培养基中35d左右开始生根，45d左右根伸长至4cm左右。三种生长调节剂对马占相思生根影响效果最优的是IBA，其次是ABT，NAA效果最差(图11)。高浓度ABT会导致高的褐化率，ABT浓度为1.0g·L^-1时褐化率高达48.61％，1.4g·L^-1时褐化率增加到52.78％，显著高于其它处理。各处理的污染率均较低，并无显著差异。IBA、NAA处理的褐化率较低，NAA浓度增加，生根率上升，但最高生根率仅为51.39％；随着IBA浓度增加，马占相思生根率先上升后下降。IBA 0.6g·L^-1时和1.0g·L^-1时得总生根率无显著差异，但IBA0.6g·L^-1时存活生根率最高，为94.33％，显著高于其它处理(表4)。因此，IBA0.6g·L^-1处理2h为马占相思开放扦插生根最优处理(图6)，生根率为94.33％。

表4生长调节剂浓度及处理时间对马占相思扦插生根的影响^①

实施例3

1材料方法

1.1材料

从中国林业科学研究院热带林业研究所大叶相思16年生试验林中选取优良单株，在优良单株上采集枝条，先通过扦插繁殖，建立采穗圃，从一年生的采穗圃中采集腋芽饱满的枝条为研究材料。

1.2方法

1.2.1抑菌剂种类及浓度对大叶相思扦插的影响

于8月剪取大叶相思采穗圃的当年生腋芽饱满枝条，将采集的枝条剪去叶片，洗衣粉水浸泡30min，刷净后流水冲洗2h，剪成长2.0～3.0cm带腋芽的茎段。扦插于加入抑菌剂：百菌清或多菌灵的培养基中，两种抑菌剂分别设4个浓度：0.2，0.4，0.6，0.8g·L^-1。每个处理接种24个茎段，重复3次。

1.2.2外植体类型和消毒方式对大叶相思扦插的影响

将大叶相思当年生腋芽饱满枝条的第1～2腋芽茎段(上段)、第3～5腋芽茎段(中段)、分别剪成带叶、不带叶两种类型的长2.0～3.0cm带腋芽茎段，扦插于培养基中。每个处理接种21个茎段，重复3次。

1.2.3IBA、NAA、ABT浓度及处理时间对大叶相思扦插的影响

大叶相思：以IBA浓度0.4，0.6，0.8，1.0g·L^-1，NAA、ABT浓度0.4，0.6，0.8g·L^-1，分别处理2h，3h。每个处理接种24个茎段，重复3次。

1.3培养条件

培养基中添加琼脂7g·L^-1，控制pH值为6.0(抑菌剂加入前测定)，在实验室开放的实验台上接种，培养温度为25℃±2℃，每日光照12h，光照强度2500Lx。培养45d后统计褐化率、污染率、存活率、生根率。

1.4数据处理

使用Excel，SPSS19.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性。

污染率％＝污染数÷接种数×100％....................................①

褐化率％＝褐化数÷接种数×100％....................................②

存活率％＝存活数÷接种数×100％....................................③

总生根率％＝生根的外植体数÷总接种外植体数×100％..................④

存活生根率％＝生根的外植体数÷存活的外植体数×100％................⑤

其中，①+②+③＝100％。

2结果与分析

2.1抑菌剂种类及浓度对大叶相思外植体的影响

从表1可以看出，2种抑菌剂对大叶相思外植体的影响，总体来说，多菌灵的污染率较百菌清的高，多菌灵不适宜作为大叶相思扦插生根的抑菌剂。

而百菌清对大叶相思外植体的影响，随着浓度的升高，褐化率增加，污染率的变化不太明显，外植体存活率也显著降低。

综合来看，百菌清浓度为0.2g·L^-1时，大叶相思的外植体存活率最高，为83.33％(图7)。

2.2外植体类型和消毒方式对大叶相思外植体的影响

从表2可以看出，大叶相思不同外植体类型，采用不同的消毒方式，其褐化率、污染率和存活率均有显著性差异。其中，上部带叶、中部不带叶茎段，无论采用哪种消毒方式，它们的褐化率均显著高于中部带叶的茎段；而存活率则显著低于中部带叶的茎段。因此，中部带叶的茎段是3种相思适宜的外植体。

大叶相思的中部带叶茎段，采用不同方式消毒，褐化率、污染率和存活率部分有显著差异，表现为多菌灵处理3min的效果最好(图8)，存活率为100.00％。

2.3生长调节剂浓度及处理时间对大叶相思扦插的影响

大叶相思扦插于基质中25d左右开始生根，35d左右根伸长至4cm左右，最高生根率为100％。三种生长调节剂不同处理时间的扦插生根率有显著差异，处理时间对生根的影响大于生长调节剂种类的影响(表5、图12)。三种生长调节剂的处理时间为3h时对应的扦插生根率均高于各自处理2h时的生根率。NAA对应的生根率总体较低，其处理2h时浓度高于0.4g·L^-1(生根率为39.74％)生根率大幅增加，0.8g·L^-1时生根率为78.65％；处理3h时浓度的变化几乎不会引起生根率的变化。ABT 2h时生根率随浓度升高而升高，但最高也仅为85.00％；3h时生根率随浓度增加先上升后下降，当浓度为0.6g·L^-1时生根率最高为87.83％。IBA 3h时生根率随浓度上升而升高，至IBA0.8g·L^-1时生根率最高(100％)，IBA2h时生根率先上升后下降，最高生根率为92.28％。故大叶相思扦插生根最优生长调节剂为IBA0.8g·L^-1，处理3h(图9)。

表5生长调节剂浓度及处理时间对大叶相思扦插生根的影响^①

3结论与讨论

3.1结论

马大杂种相思、马占相思及大叶相思扦插生根的研究并不多，且尚未见对三者进行开放扦插生根的研究。本实验结合开放组培的思路，以一种全新的方式对三种相思进行扦插：

加入抑菌剂进行开放式培养，并不要求严格无菌，在整个培养环节中完全不使用高温高压灭菌和超净工作台，区别于目前开放式光自养微繁技术，不使用任何特殊的培养设备及培养条件，培养环境中允许有菌；借鉴前人对培养基研究的经验，选择最简化的培养基质，进行扦插研究。本研究以课题组已成功建立的开放操作，对抑菌剂种类、浓度，适宜的外植体类型，以及扦插生根促成剂进行筛选，获得更为简单易行，生根率较高的扦插生根体系：以琼脂7g·L^-1，加抑菌剂百菌清0.2g·L^-1为培养基质，外植体选择中部带叶类型，以多菌灵0.8g·L^-1消毒3min后，以适宜的生根剂浸泡：IBA1.0g·L^-1处理2h(马大杂种相思)、IBA0.6g·L^-1处理2h(马占相思)、IBA0.8g·L^-1处理3h(大叶相思)，在开放的实验台上接种至扦插基质中，生根率分别为：100％，94.33％，100％。建立的开放生根体系，使三种相思的扦插基质成分简单可控，对今后深入开展相思扦插生根机理研究具有重要的现实意义。

3.2讨论

找到适宜的抑菌剂是脱离严格无菌环境进行培养的关键，但适宜的抑菌剂筛选较困难，不同物种对抑菌剂的种类、浓度及组合方式有不同的要求，难以找到具有普适性的抑菌剂。对多菌灵、代森锰锌、利福平、山梨酸钾、链霉素、青霉素、氨苄西林钠、硫酸庆大霉素、羧苄青霉素9种抑菌剂进行筛选，发现仅多菌灵和代森锰锌适宜长柄扁桃的培养(孙占育等，2013)。多菌灵对微球菌和杜氏青霉不能有效抑制，百菌清仅能抑制黑曲霉菌种(张薪薪等，2005)。多种植物中提取的生物组成物，与植物组织亲和力高，可渗入植物内部，对植物内生菌有一定抑制作用，对植物的外植体的伤害也较小(崔刚等，2004)，但此类合成型抑菌剂成分较多，获取不易，不利于在生产、研究中的运用。本研究中选取了生产中常用的效果较好的广谱性抑菌剂：百菌清、多菌灵，结果三种相思适宜的抑菌剂均为百菌清，适宜的浓度0.2g·L^-1，污染率较低；多菌灵的污染率均较高，对微生物的抑制效果较差，这与张薪薪等人(2005)的研究结果不一致，这可能是抑菌剂在不同培养环境、不同物种培养中表现出的差异性导致。因此，在今后不同物种培养中，仍应重视对抑菌剂筛选工作，以求找到能适应多个物种培养的方便获取的抑菌剂。

在培养瓶内进行扦插生根，外植体的预处理和选择是培养成功的首要关键步骤，目前多用浓度较高的升汞对外植体进行消毒，对外植体的毒害作用较大。也有学者们对其它具有抑菌作用的物质进行了尝试，用利福平溶液对番木瓜侧芽预处理，有效降低了污染率，并对生长无毒副作用(Reuveni O，et al.，1990)。用多菌灵、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、柠檬酸、氨苄青霉素的混合液对宽叶紫荆木的茎段进行预处理，减少了霉菌、细菌的污染(Sing H P，et al.，1992)。但由于这些具有抑菌效果的物质并不是对所有微生物都有效，且不同来源的外植体带的主要微生物也不同，针对不同树种、来源的外植体需要进行对应的筛选。本实验中选用多菌灵0.8g·L^-1对外植体进行预处理，三种相思均选中部带叶的茎段为外植体，以0.8g·L^-1浸泡3min，均获得了高的存活率：96.83％(马大杂种相思)、90.48％(马占相思)、100％(大叶相思)。

培养基中无糖，进行外植体光自养培养，能进一步简化培养基，使培养的污染可能性大幅下降，但目前的光自养技术多依托于特殊的培养条件：需要特殊的培养容器、培养环境中CO₂浓度需控制、以及特殊的光照模式。开放式光自养，以生根为目的时，使用透气性好(如蛭石、珍珠岩、河沙等)的培养基质生根效果较好(丁国昌等，2009)。但对黒木相思光自养微繁的研究中，使用透气性较差的琼脂培养基，获得的生根率(85％)也较高(丁国昌等，2010)。本研究以水加琼脂为扦插基质，以适宜的生长调节剂处理，获得了更高的生根率，100％(马大杂种相思)，94.33％(马占相思)，100％(大叶相思)。可见透气性差的琼脂培养基同样适于做光自养微繁生根的培养基质。另，此成分简单可控的基质可运用于生根机制的研究，对科学研究而言，具有如蛭石等复杂培养基质不具备的优势。

抑菌剂的加入对外植体的生长有一定影响，外植体对生长调节剂处理的响应会有何变化的研究尚少。本课题组以黄心土为扦插基质，已获得三种相思传统扦插方式的适宜处理，IBA处理的效果最佳，马大杂种相思以IBA0.4g·L^-1处理2h，生根率为93.33％(易敏等，2014)；马占相思以IBA0.4g·L^-1处理2h，生根率为84.2％(易敏等，2010)；大叶相思以IBA0.2g·L^-1处理2h，生根率为90％(易敏等，2011)。本实验中适宜的生长调节剂均为IBA，与传统扦插的一致，但IBA浓度及处理时间上有所差别：IBA1.0g·L^-1处理2h(马大杂种相思)、IBA0.6g·L^-1处理2h(马占相思)、IBA0.8g·L^-1处理3h(大叶相思)，适宜浓度均高于传统的扦插培养，处理时间也有更长的趋势，具体原因有待进一步的实验探究。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。