福寿螺内源性纤维素酶eg27i在毕赤酵母中的组成型表达与纯化的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及福寿螺内源性纤维素酶，尤其涉及福寿螺内源性纤维素酶EG27基因 的重组表达质粒的构建，以及在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)中的组成型高表达以 及重组酶发酵生产和纯化方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是一种复合酶系，在酶系中各组分的协同作用下可水解纤维素产 生葡萄糖。根据纤维素酶水解纤维素的机理，可以将纤维素酶分为三类：葡聚糖内切 酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4);葡聚糖外切酶（纤维素外切酶（exoglucanases，EC 3. 2. 1. 91)以及 β -葡萄糖苷酶（β -glucosidase, EC 2. 1. 21) 〇
[0003] 纤维素酶在工业上的应用十分广泛，例如，其在水果蔬菜加工业、饲料业、饮料业、 酿造发酵工业、纺织工业、医药工业以及新能源领域都有广泛的用途。
[0004] 很多有机体都可以产生内源性的纤维素酶，包括微生物（细菌、放线菌、真菌）、 植物以及一些动物。工业上应用较多的纤维素酶大多来源于木霉属（Trichoderma)、 曲霉属（Aspergillus)以及青霉属（PeniciIlium)等微生物。动物内源性纤维素酶 的发现较晚，直到1997年才开始有动物内源性纤维素酶基因被克隆得到[Watanabe Η et al.Cell Nature，1998,394:330-331;Tokuda G et al.Zool Sci， 1997, 14:83-93; Tokuda G et al.Genebank submission，Accession No. AB013273, 1998 ；Yan Y et al. Gene, 1998, 220:61-70]。相较于工业上常用的微生物来源的纤维素酶，动物内源性纤维 素酶往往具有更好的温度稳定性和pH稳定性，而且常具有较高的比活力。
[0005] 虽然动物内源性纤维素酶具备诸多优点，但是通过组织纯化法生产效率极其低 下，并且通过重组表达的方法产量也普遍不高（最高为31mg/L)。Shahram Khademi[Acta Crystallographica,Section D, Biological Crystalography,2002,58 (Pt4):653-659] 等通过将白蚁来源的纤维素酶NtEG与三种分子伴侣dnaK、dnaj、GroEL在大肠杆菌中共 表达，成功表达了有活力的重组蛋白，但其表达量十分微弱。Ni等[Biosci Biotechnol Biochem, 2005, 69:1711-1720 ;Protein Eng Des Sel, 2007,20:535-542]人以四种白蚁来 源的纤维素酶为模版，通过DNA shuff ling得到两种突变体PA68和A18,其中PA68的最高 表达量是20mg/L，然而天然的RsEG和NtEG重组表达依旧没有成功；Kayoko Hirayama等 [Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(8) :1680-1686]在米曲霉（Aspergillus oryzae) 中重组表达了 RsEG和NtEG，其重组表达量分别为26mg/L和31mg/L，这是文献报道的动物 内源性纤维素酶重组研究中已知的最高表达量。
[0006] EG27是软体动物福寿螺来源的一种动物内源性纤维素酶，属于GHF45家族，最适 温度为50°C，最适pH为5. 0,具有良好的温度稳定性和pH稳定性，在60°C温浴24小时后仍 然残留了 80%的酶活力，在ρΗ3· 0-12. 0、30°C温浴24小时后酶活力基本保留完全。天然的 EG27I的比活力约为llU/mg，与工业上常用的里氏木酶来源的纤维素酶的比活力相当。由 于EG27I的这些特点，因此在工业上具有良好的应用前景，但是与其他来源的动物内源性 纤维素酶一样，EG27I的重组表达也十分的困难。Rui Guo等使用pPIC9K载体在毕赤酵母 中对EG27I进行了重组表达，其表达量仅为0. 7mg/L。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种在pGAPZ α A载体基础上改进的毕赤酵母表达 载体pGAPH，包含Kozak sequence (GCCACC)和经密码子优化后的里氏木霉来源的疏水球蛋 白HFBII的分泌信号肽的核苷酸序列：
[0008] ATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCT。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供一种利用上述载体构建的福寿螺内源性纤维素酶 EG27I的重组表达质粒pGAPH-EG27I。
[0010] 本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组质粒PGAPH-EG27I的毕赤酵 母基因工程菌株PGAPH-EG27I/SMD1163。
[0011] 本发明的第四个目的在于提供一种利用上述毕赤酵母基因工程菌重组表达EG27I 的发酵培养方法。
[0012] 本发明通过基因合成，合成了一段 dsDNA 序列（5, -ACTCAATTGAACAACTATTTCGCCA CCATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCTGAATTCGGTACCAAT-3' ），经 Mfel 和 ΚρηΙ限制性酶切后与pGAPZ α A载体相连，得到改造后的载体pGAPH。
[0013] 本发明通过 PCR 方法从 pPIC9K_eg27I 质粒[Rui Guo et al. Acta Biochim Biophys Sin, 2008:419-425]中扩增出了 EG27I基因，经限制性酶切后与上述构建的pGAPH 质粒相连接，得到重组表达质粒PGAPH-EG27I。经测序鉴定正确后，转化大肠杆菌DH5 α进 行亚克隆。提取重组表达质粒，经Blnl线性化后，转化毕赤酵母SMD1163,获得组成型、高表 达基因工程菌株PGAPH-EG27I/SMD1163。
[0014] 获得上述基因工程表达菌后，接种至30L发酵罐，进行分批补料培养。发酵培养 基为 Invitrogen 推荐的 Fermentation Basal Salts Medium[Invitrogen corp S D, CA. A manual of methods expression of recombinant proteins in pichia pastoris, 1998]〇
【附图说明】
[0015] 附图1、pGAPH载体示意图
[0016] 附图2、SDS-PAGE分析EG27I的表达
[0017] 附图3、EG27I发酵培养过程的生长曲线及酶活力曲线
【具体实施方式】
[0018] 本发明通过以下实施例进一步阐述，但并不限制本发明的范围
[0019] 实施例lpGAPH载体的构建
[0020] 通过基因合成一段如下dsDNA :
[0021] 5 ' -ACTCAATTGAACAACTATTTCGCCACCATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCT TTGGCTGAATTCGGTACCAAT-3'，该dsDNA经Mfel和ΚρηΙ限