一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及激素检测技术领域，具体涉及一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条。
【背景技术】
[0002]孕酮(progesterone)亦称黄体酮，是天然的孕激素，由卵巢和胎盘产生，分子量为314.46，它与雌激素共同维持女性生殖周期及女性生理特征。动态监测血清中的孕酮含量，有助于判定排卵期，了解黄体功能，研究各种类固醇避孕药及抗早孕药的作用机理。此外，近年来研究表明，孕酮的作用已远超出生殖功能的范畴，它不仅可在神经系统中合成分泌，还能影响神经系统的结构和功能。
[0003]孕酮与人体的内分泌调整密切相关，孕酮在女性的不同生理周期阶段起着关键的调节作用，孕酮的失调会直接影响人体健康。所以检测人体孕酮浓度是女性健康诊断的重要指标。在现有的孕酮检测方法中一般都是基于尿液或者血液来检测，在取样的过程中给用户带来了不便或痛苦。
[0004]由于孕酮对人身心健康的重大影响，医学、生物、环境及食品安全等各领域对该物质进行了深入研究，并建立了多种测定方法。目前孕酮的检测方法大致可以分为两类:色谱法和免疫分析法。色谱法作为检测血清中孕酮的标准方法，在准确性、选择性、重现性、灵敏度等方面具有无可比拟的优势，但同时也存在一些局限性:如仪器昂贵，操作技术要求高，需要复杂的样品前处理等。因此，在临床检测中，色谱法不能满足快速、简便、低成本、高通量的要求。而免疫分析方法具有特异性好、简便、低成本等优点，是目前临床检测孕酮的主要方法。放射免疫分析(rad1 immunoassay，RIA)、酶联免疫分析(enzyme I inkedimmunoadsorbent assay ,ELISA)、焚光免疫分析(f luoroimmuno assay，FIA)、时间分辨焚光免疫分析(time resolved f luoro immuno assay，TRFIA)和化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)用于人血清中孕酮的检测都有报道。RIA使用放射性核素，污染环境，有效期短，测量时间长，这些缺点限制了其进一步的应用。ELISA和FIA的灵敏度较低，不利于血清中低浓度孕酮的测定。TRFIA和CLIA克服了以上方法的缺点，国外已经实现了分析技术完全自动化，但这些进口的诊断试剂往往需要专门配套的仪器，试剂、仪器价格昂贵;此外，其专利保护也限制了这些技术在我国国内的研发。
[0005]中国专利申请公布号01^102095866六(公开日2011.06.15)公开了一种孕酮化学发光定量检测试剂盒，包括孕酮检测反应板，反应板包被有孕酮抗体，还包括酶结合物、发光底物、校准品、质控品和浓缩洗涤液。其适用的检测样本仍然为血清或血浆。
[0006]传统的各种检测方法，过程复杂，耗时长，成本高，并且不能保证批间的稳定性。
【发明内容】
[0007]为了解决现有检测技术中的上述问题，本发明基于胶体金标记适配体识别孕酮特异性抗原的技术原理，提供了一种孕酮的核酸适配体，其相应的互补探针，以及由其组成的金标试纸条。
[0008]本发明提供的一种孕酮的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其中序列5’端经过巯基修饰。该核酸适配体能够特异性识别孕酮并与其结合。
[0009]SEQ ID N0:15’-SH-GGCACGGCAAAGGGGTACAGCCTACCGAACCGTGGCTGTAAGGGTGGTTGTGGTGTG-3’ ο
[0010]本发明提供的一种互补探针A，与上述孕酮的核酸适配体互补配对，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，其中序列5’端经过生物素修饰。互补探针A能够与孕酮竞争性结合上述核酸适配体。
[0011 ] SEQ ID NO:25 ’-b1tin-CACACCACAACCACC-3 ’。
[0012]本发明提供的一种互补探针B，与上述孕酮的核酸适配体互补配对，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，其中序列5’端经过生物素修饰。互补探针B能够与上述核酸适配体的另外一部分结合，该部分不同于与孕酮结合的序列段，也就是说，互补探针B与孕酮之间没有竞争关系。
[0013]SEQ ID N0:35’-b1tin-CACACCACAACCACCCTTACAGCCACGGTT-3’。
[0014]本发明公开的一种检测孕酮的金标试纸条，是在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端;其中核酸探针金标垫上附着表面经修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成；
[0015]所述胶体金的表面经过活化了巯基的孕酮的核酸适配体修饰；
[0016]核酸适配体A溶液包括结合了链霉亲和素的互补探针A;
[0017]核酸适配体B溶液包括结合了链霉亲和素的互补探针B。
[0018]以上金标试纸条，特别适合于唾液中孕酮的检测。通过适配体检测唾液中的孕酮浓度，利用唾液中微量的孕酮浓度与血液中的孕酮浓度存在显著相关性，从而推算出人体的孕酮水平，为一种非侵入式检测方案，可用于监测女性的生理周期及健康状态。
[0019]本发明的金标试纸条，检测线中的互补探针A与孕酮竞争性结合核酸适配体。检测时，将唾液样品浸润或滴加到样品玻璃纤维膜，由于毛细现象，唾液向样品玻璃纤维膜的对向端渗透，渗透的过程中孕酮会与核酸探针金标垫的核酸适配体结合并继续一起移动，核酸适配体一端有连接着胶体金颗粒，核酸适配体与胶体金颗粒的结合体将吸附在检测线和参照线上，最终显色的深浅通过与标准色(梯度浓度标准品在金标试纸条上的显色情况)对比就能得到孕酮的浓度。当唾液中含有高浓度的孕酮时，孕酮与互补探针A竞争性结合核酸适配体，从而检测线颜色就会变弱。阴性对照(空白对照)是有两条线都显色，因为当唾液中不含有孕酮，两条互补探针都会截留孕酮的核酸适配体。
[0020]优选地，上述金标试纸条，所述胶体金溶液的制备方法如下:
[0021]将醋酸缓冲液和TCEP溶液混合，再向其中加入孕酮的核酸适配体，进行巯基活化反应，反应结束后向其中加入金纳米粒子溶液，震荡；再加入dATP，25 °(:震荡反应后静置30分钟，再在4°C下静置6小时;然后离心，沉淀用磷酸缓冲液溶解既得。
[0022]优选地，上述金标试纸条，所述醋酸缓冲液浓度为0.5M，pH值6.5，用量IyL;所述TCEP溶液的浓度为10mM，用量1.5yL;所述dATP浓度ΙΟμΜ，用量85yL;所述金纳米粒子粒径30?40nm，用量10yL;所述磷酸缓冲液浓度0.01M，pH值7.4，用量520yL。
[0023]优选地，上述金标试纸条，所述互补探针A溶液制备方法为:将40?SOyLI?100D值的生物素修饰的互补探针A溶液和200?300yL I?5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入500?600yL 0.001?1.000M pH值6.0?8.0的磷酸盐缓冲溶液。
[0024]优选地，上述金标试纸条，所述互补探针B溶液的制备方法为:将40?SOyLI?100D值的生物素修饰的互补探针B溶液和200?300yL I?5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入500?600yL 0.001?I.000Μ pH值6.0?8.0的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的互补探针B溶液。
[0025]本发明还提供了以上任一所述的金标试纸条的制备方法，是将样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜依次粘贴到塑料衬板上，相邻两粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，干燥封装，在4°C?25°C条件下保存。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0027]1、本发明将纳米粒子比表面积大这一显著特点应用于传统的金标试纸条的建立和相应的检测方法，建立了可用于现场快速超灵敏检测的基于核酸探针的胶体金标记试纸条和相关的检测方法，通过肉眼直接观察实现目标检测物的快速定性检测和通过检测条带上显色程度的降低对目标检测物进行定量检测。无需其他辅助仪器设备，检测工作可在10?15分钟内完成并得到检测结果。
[0028]2、本发明为通用型基于胶体金标记适配体的胶体金标记试纸条，只需将试纸条中适配体进行相应替换，即可实现其他目标物的检测。
[0029]4、本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉，操作使用方法简单易于推广应用。可应用于医院、家庭、以及食品安全与检验检疫的海关、机场等口岸等需要现场快速检测机构。
[0030]5、本发明中的检测方法不需要穿刺取血或取尿液，只需要取唾液，取样简单，属于非侵入式检测，检测方法简单，成本低廉。
[0031 ] 6、本方法检测的灵敏度和高，监测浓度可以达到pmol级别。
【附图说明】
[0032]图1为基于胶体金标记抗体的金标试纸条的侧面结构示意图，图中序号:I样品玻璃纤维膜、2核酸探针金标垫、3硝酸纤维膜、4检测线、5参照线、6吸水玻璃纤维膜、7塑料衬板；
[0033]图2为基于胶体金标记抗体的金