一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。属 于生物疫苗制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺组织受 到微生物感染而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛 常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物 大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的奶 牛乳房炎占总发病率的90%以上，其中尤以金黄色葡萄球菌为最。
[0003] 当前奶牛乳房炎的治疗方法主要是采用抗生素治疗，抗生素用于治疗奶牛乳房炎 已有50多年的历史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂 量的不科学使用抗生素，引起了敏感性细菌的消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄 色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微。
[0004] 用疫苗来防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌 而引起乳房炎;其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎;第三，使 用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题;最后是操作简便，费用低廉。当前，研 制成功的疫苗很少，且大都数为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有 一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返 强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性 与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。
[0005] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称SA)，也称"金葡菌"，是一种革兰 氏染色阳性的球菌，直径〇.8μπι，在显微镜下排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，并 因此而得名。金葡菌是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶 的产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。
[0006] 金葡菌可产生多种毒素和酶。α-溶血素(α-hemolysin)，亦称α-toxin，是由金葡菌 分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。a-溶血素属于中空形状 的桶状结构细菌毒素家族，相对分子质量为33，200，由297个氨基酸组成，其结构基因为 hAua-溶血素对多种哺乳动物红细胞具有溶血作用，其机理为毒素分子插入红细胞的细胞 膜疏水区，形成微孔，破坏了细胞膜的完整性，造成细胞溶解。将溶血素第35位组氨酸突 变为丙氨酸后，突变体就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直 接用来免疫动物，是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种奶牛金黄色葡萄球菌a-溶血素亚单位疫苗的制备方 法及应用。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可 促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更 加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。
[0008] 所述的重组α-溶血素蛋白来自金黄色葡萄球菌，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID Ν0.2所示。
[0009] 本发明还提供一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法，主要包 括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白的第35位的组氨酸定点突变为丙氨酸;2) 将定点突变的α_溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化 E.coli BL21(DE3)，诱导表达获得重组α-溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析和Resource S 柱纯化步骤3)得到的重组α-溶血素蛋白；5)将纯化得到的重组α-溶血素蛋白与药学上可接 受的佐剂（如ISA 206VG佐剂）充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫 苗。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：奶牛乳房炎亚单位疫苗即利用 致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入 机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚 单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免 疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉， 且省时省力具有显著疗效的新型疫苗。
【附图说明】
[0011]图1、α-溶血素分段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，M:Marker DL2，000; 1是α-溶血 素定点突变片段1 (128bp)，2是α-溶血素定点突变片段2(795bp)。
[0012]图2、α-溶血素定点突变重叠 PCR琼脂糖凝胶电泳结果，M:Marker DL5,000;1是α-溶血素定点突变重叠 PCR产物(891bp)。
[0013] 图3、α-溶血素定点突变重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果，M:Marker DL5000;1是pET28a-a-溶血素定点突变1号质粒(NcoI/XhoI)，2是pET28a-a-溶血素定点突 变 2 号质粒(Ncol/Xhol)。
[0014] 图4、SDS-PAGE检测α-溶血素镍柱亲和层析纯化结果，FT:flow through;50mM: 50mM咪唑；lOOrnM: lOOmM咪唑；150mM: 150mM咪唑；200mM: 200mM咪唑；250mM: 250mM咪唑。 [0015] 图5、SDS-PAGE检测Resource S柱纯化镍柱纯化洗脱部分（50mM到250mM咪唑洗脱 部分)结果。
[0016]图6、ELISA检测α-溶血素亚单位疫苗免疫小鼠后效价结果。
[0017] 图7、免疫攻毒后小鼠存活率实验结果。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1表达载体pET28a-a-溶血素定点突变的构建
[0019] 以临床分离到的奶牛金黄色葡萄球菌基因组为模板，将α-溶血素分成两段进行 PCR，结果如图1所示。
[0020] 1 · 1加样体系为(50μ1):
[0021] 1.2 PCR扩增程序：
[0022] 1.3胶回收DNA片段：
[0023] (1)将步骤1.2的反应液进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(110V 30min);
[0024] (2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5ml EP管中；
[0025] (3)向步骤（2)中的 1.5ml EP管中加入500μ1 PC 13肚€6广50。(：，水浴1〇11^11;
[0026] (4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000rpm，30s;
[0027] (5)弃废液，向吸附柱中心加入600μ1 PW buffer，静置3min，12,000rpm，30s;
[0028] (6)重复步骤(5);
[0029] (7)空吸附柱离心，12,000rpm，lmin;
[0030] (8)向吸附柱中心加入30μ1 ddH2〇,静置3min，离心（12,000rpm，2min);
[0031] (9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。
[0032] 1.4重叠 PCR，将α-溶血素进行定点突变，结果如图2所示：
[0033] 加样体系为(50μ1):
[0034] PCR扩增程序：
[0035] 1.5双酶切反应(5(^1体系）：
[0036] 在1.5 ml EP管中按照步骤1.5进行加样、混匀，而后将这两个50μ1反应液置于37 °C恒温水浴锅中，水浴3h。
[0037] 1.6胶回收DNA片段：
[0038] (1)将步骤1.5的反应液进行0.8%琼脂糖凝胶电泳（110V 30min);
[0039] (2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5ml EP管中；
[0040] (3)向步骤（2)中的 1.5ml EP管中加入500μ1 PC 13肚€6广50°(：，水浴1〇11^11;
[0041 ] (4)将步骤⑶中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12，OOOrpm，30s;
[0042] (5)弃废液，向吸附柱中心加入600μ1 PW buffer，静置3min，12,000rpm，30s;
[0043] (6)重复步骤(5);
[0044] (7)空吸附柱离心，12, OOOrpm，lmin;
[0045] (8)向吸附柱中心加入30以1(1(1!12〇，静置3111；[11，离心（12,000印111，2111；[11);
[0046] (9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。
[0047] 1.7连接反应（1(^1体系）：
[0048] 在1.5ml EP管中按照上述体系进行加样、混匀，而后将上述反应液置于16°C，水浴 16h后取出，65°C，水浴15min后进行灭活，将样品4°C保存。
[0049] 1.8转化实验：
[0050] (1)取出步骤1.7的连接反应液，向其中添加 100μΙ E.coli DH5a感受态细胞，混 匀；
[0051 ] (2)冰浴 30min;
[0052] (3)42°C，水浴 100s;
[0053] (4)冰浴 2min;
[0054] (5)取出，向EP管中加入600μ1液体LB培养基，37°C，水浴lh;
[0055] (6)取出样品管，离心(8,000rpm，2min)，去掉600μ1，剩余100μΙ LB重悬菌体；
[0056] (7)取菌液铺板于LK平板中（Kan浓度为50μg/ml)，将LK平板置于生化恒温培养箱 中，37°C培养12h。
[0057] 1.9重组质粒提取及酶切鉴定：
[0058] (1)从转化平板中挑取单克隆至3ml LK液体培养基中，37°C，260rpm摇菌过夜；
[0059] (2)取lml菌液至 1.5ml EP管中，离心（12,000rpm，2min)，弃上清；
[0060] (3)向步骤(2)中的EP管中加入250μ1 Plbuffer，重悬菌体；
[0061 ] (4)向步骤(3)溶液中加入250μ1 P2buffer，温和混匀，静置2min;
[0062] (5)向步骤(4)溶液中加入350μ1 P3buffer，温和混匀；
[0063] (6)将步骤(5)溶液，离心（12，OOOrpm，1 Omin);
[0064] (7)将步骤(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，离心(8，OOOg，30s);
[0065] (8)弃废液，向吸附柱中心加入500μ1 wash buffer，离心（9,000g，30s);
[0066] (9)重复步骤(8);
[0067] (10)空吸附柱离心(9,000g，lmin);
[0068] (11)向吸附柱加入30μ1 Elution buffer，静置2min，离心（12,000rpm，2min);
[0069] (12)收集步骤(ll)DNA样品进行电泳；
[0070] (13)如步骤1.5所示，对提取到的质粒进行酶切鉴定，而后进行0.8%琼脂糖凝胶 电泳。
[0071] 重组质粒酶切鉴定结果见图3。
[0072]实施