人乳头瘤病毒58e7蛋白表达纯化方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属生物技术领域，涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备，具体涉及人乳头 瘤病毒58型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，我国宫颈癌发病率居世界第二位，且 呈逐年升高和年轻化的趋势，其中青年女性30岁）中宫颈癌发病率以每年2%_3%的速 度增长。研究证实，高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)的持续感染是宫颈 癌及癌前病变发生的主要原因。HPV58属于高危型HPV病毒中的一种常见亚型，在我国宫颈 癌患者中，HPV58感染病例数占总HPV感染病例数的11.5%~28%，仅次于冊￥16和冊￥18， HPV-58E7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持，也可作为感染干预性研究提供理 论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法，HPV-58E7蛋白抗体的发明可为HPV临床检测提供 新的方法，同时为科学研究提供新的方法学基础。
[0003] HPV 58型是引起宫颈癌的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR，容易造 成假阳性，或假阴性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达、纯化方法，通过 以下步骤实现：
[0005] (1 )HPV-58E7基因的调取及扩增：设计HPV-58E7的扩增引物，并从HPV-58阳性人宫 颈上皮细胞中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV-58E7序列的上游引物 序列为SEQ ID NO· 1:5' -CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3'，划线部分为BamH I酶切位 点，下游引物序列为SEQ ID NO.2:5'-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3'，划线部分为 EcoR I酶切位点；
[0006] 用于扩增真核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQ ID NO.Sd'-CCG^X^ATGAGAGGAAACAACCCAACGC-S '，划线部分为EcoR I酶切位点，下游引物序列为SEQ ID NO. 4:5 ' -CCGGGATCCTTATTGCTGTGCA CAGCTAGG-3'，划线部分为BamH I酶切位点；
[0007] (2 )HPV-58E7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤（1)中得到的这两个含不同 酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得用于 后续实验的重组载体PGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-Cl-(HPV-58E7);
[0008] (3)GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表达:将步骤（2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)转入大肠埃希菌DH5a，待细菌〇D值介于0.6-0.8之间，加1?了6至终浓度为 0.2mM，并在26-28°C的诱导温度下，诱导4-6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时 间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清；
[0009] (4 )GST-( HPV-58E7)融合蛋白的纯化及HPV-58E7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的 上清与Glutathione-Sepharose 4B 磁珠 （GE healthcare)结合，再用凝血酶（GE heal thcare)切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV-58E7蛋白。
[0010]在设计蛋白表达载体时，选择含GST标签的PGEX-4T2，有利于蛋白表达的可溶性， 且在蛋白纯化后，可将GST标签切除，使获得的蛋白更接近天然HPV-58E7蛋白。在诱导蛋白 表达时为避免形成不可溶的包涵体，采取了优化IPTG浓度，诱导时间，降低了诱导温度等措 施。
[0011] 大肠埃希菌宿主DH5a、真核表达载体PEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa。原核表达 载体pGEX_4T2从GE health care公司购得。
[0012] 本发明的另一个目的是提供人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白在制备多克隆抗体中 的应用。本发明获得的人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化 获得高特异性、高效价比的多克隆抗体。
[0013] 利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建，在引物的两端引入酶切位 点，通过酶切产生粘性末端，可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见(J.萨姆布鲁 克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2008.)。
[0014] 转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法，如电穿孔、制备感受态细胞等。成功 转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细菌经收集并裂解，提取质粒，然后PCR鉴 定、酶切鉴定或测序鉴定。
[0015] 体外获得HPV-58E7蛋白，是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达 GST-HPV-58E7融合蛋白，经过纯化，并切除GST标签蛋白，最终得到HPV-58E7蛋白。该蛋白在 宫颈癌发病机制研究中极具前景，是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。
[0016] 病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表达极容易形成不溶性的包涵体，申请 人前期在大量的实验条件下，摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签，并降低 IPTG浓度，降低诱导时的温度，缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性， 从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯 化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本。为进一步研究治疗宫颈癌奠定基 础。
[0017] HPV 58型是引起宫颈癌的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR，容易造 成假阳性，或假阴性。HPV-58抗体的发明可通过免疫组化，免疫荧光，酶联免疫吸附反应等 技术来检测HPV 58型病毒的感染，并且可与PCR技术联用，来检测HPV 58型的感染，能大大 提高检测的准确率。
【附图说明】
[0018] 图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-58E7)的电泳示意图。图中泳道Ml:TaKaRa DL 2， 000DNA marker;泳道1:HPV-58E7基因（用PCR法从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞中扩增得 到）；泳道2:pGEX-4T2质粒;泳道3:pGEX-4T2质粒经EcoR I和BamH I酶切;泳道4:重组pGEX-4T2-HPV-58E7质粒；泳道5:重组pGEX-4T2-HPV-58E7质粒经EcoR I 和BamH I 酶切；泳道M2: TaKaRa DL 15,000DNA marker。
[0019] 图2为重组质粒pEGFP-Cl-(HPV-58E7)的电泳示意图。图中泳道Ml:TaKaRa DL 2， 000 DNA marker;泳道 1:HPV-58E7 基因（用 PCR 法从 pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒中扩增得 到）；泳道2 : pEGFP-Cl质粒；泳道3 : pEGFP-Cl质粒经EcoR I和BamH I酶切；泳道4 :重组 pEGFP-Cl-(HPV-58E7)质粒；泳道5:重组pEGFP-Cl-(HPV-58E7)质粒经EcoR I和BamH I酶 切；泳道M2: TaKaRa DL 15，000DNA marker 〇
[0020] 图3为重组蛋白GST-HPV-58E7诱导表达的PAGE分析。图中泳道M:蛋白预染marker; 泳道1:含PGEX-4T2-HPV-58E7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的上清；泳道2:含 PGEX-4T2-HPV-58E7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的沉淀。
[0021 ] 图4为重组蛋白GST-HPV-58E7诱导表达后纯化、酶切的PAGE分析。图中泳道Μ:蛋白 预染marker;泳道1、2:纯化酶切后的HPV-58E7蛋白；泳道3、4:透析后的HPV-58E7蛋白。 [0022] 图5为Western blotting检测HPV-58E7在293T细胞中的表达。图中泳道1:293T;泳 道2:293T 转染 pEGFP-Cl 质粒；泳道3:293T 转染 pEGFP-Cl-HPV-58E7 质粒；泳道 4: HPV-58E7 蛋 白。
[0023] 图6为免疫荧光检测HPV-58E7在293T细胞中的表达。
[0024] 图7为免疫组化检测HPV-58E7病理标本中的表达。图中白色箭头:未感染HPV-58E7 的细胞，黑色箭头:感染HPV-58E7的细胞。
【具体实施方式】
[0025]本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。
[0026] 实施例1:HPV 58型E7基因原核表达载体的构建
[0027] 用PCR方法从HPV-58阳性人宫颈上皮细胞扩增出HPV-58基因（SEQIDN0.5)，所用 的引物HPV-58E7_P up(SEQ ID N0.1)、HPV-58E7_P dn(SEQ ID N0.2)由擎科生物合成。用 于原核表达的上下游引物分别引入BamH I和EcoR I酶切位点
[0028] HPV-58E7_P up:5，-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3，
[0029] HPV-58E7_P dn：5；-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3'
[0030] PCR反应条件：50yL反应体系中，加入5yL HPV-58阳性人宫颈上皮细胞溶液，20μ mol/L的上下游引物各lyL，2 · 5mmol/L的dNTP mixture 4yL, 5 X Buffer(Mg2+plus) 10yL, rTaq聚合酶0.5yL，剩余用ddH20补足。用ABI公司的（型号为2720 )PCR仪，PCR反应条件为94 °C预变性5min;94°C变性30s;56°C退火30s;72°C延伸30s，共40个循环以后，再72°C延伸 7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为317bp的用与原核表达的DNA片段。将上述扩增的 产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
[0031] 原核表达质粒PGEX-4T2及HPV-58E7序列用EcoR I和BamH I双酶切，以适当比例将 上述线性PGEX-4T2和HPV-58E7基因片段混合，用T4DNA连接酶在16°C水浴中连接过夜。然后 转化入DH5a后，铺于含l〇〇 yg/mL Amp的LB琼脂平皿，37°C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接 种5mL含100yg/mL Amp的LB液体培养基中，37°C培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒，并用EcoR I和Ba