远缘杂交小麦的ssr分子标记引物及用途和筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小麦遗传育种领域，尤其涉及一种远缘杂交小麦的SSR分子标记引物 及其用途和筛选方法。
【背景技术】
[0002] 小麦赤霉病（FHB)主要是由小麦感染禾谷镰刀菌引起的。它多发生在温暖湿热的 地区。由于近十年来空气污染带来的全球气候变暖，小麦赤霉病的受害面积逐年扩大，使得 小麦产量降低。在我国，小麦作为仅次于水稻的主要粮食作物，历年种植面积为全国耕地 总面积的22-30%和粮食作物总面积的20-27%，分布遍及全国各省（市、区）。小麦赤霉 病在我国长江中下游和华南冬麦区及东北东部春麦区尤为严重，近年在黄河流域及其它地 区也偶有发生。近年来，小麦赤霉病在国内有向北方麦区扩展的趋势，我国有三分之二的省 份发生赤霉病，严重流行时，受害面积超过700万公顷。
[0003] 培育赤霉病抗性品种是目前防治小麦赤霉病危害的最有效的手段之一。导致小麦 赤霉病发生发展的因素很多。环境和病原菌的不同，都会影响到对赤霉病抗性的评价结果。 如遇到少雨天气，采用田间鉴定就有可能会出现假抗病性。并且这种方法的周期较长，不容 易做重复鉴定。所以就同时需要其他的方法进行辅助。毒素鉴定法就补充了田间鉴定的缺 陷。它的结果还可以反证田间鉴定的结果。
[0004] 由于小麦赤霉病抗性具有典型的数量性状特征，受多基因控制，易受环境影响，早 期世代很难对其进行选择。此外，许多抗赤霉病种质的农艺性状较差，地区适应性较强，利 用传统育种方法培育抗性品种费时费力可能也得不到预期的结果，分子标记及其辅助选择 育种，为小麦育种提供了一条有效的途径。利用分子标记，可直接对品系的基因型进行选 择。它可以大大减弱环境条件对结果的影响。并且它的周期短，可在播种后数天对幼苗进 行检测。这将大大节省，培育植株中所浪费的人力，财力和物力。
[0005] 利用DNA分子标记技术，可较好地探明其抗性QTL的位点，进行小麦抗赤霉病的辅 助选择育种。利用分子标记鉴定，具有准确、快速的特点。通过目标性状相关分子标记的辅 助选择结合与综合性状优良的小麦品种回交，可望打破性状的不良连锁，从而培育出抗赤 霉病优质丰产小麦新品种。SSR和DArT标记具有丰富遗传变异的特点，在小麦的基因作图 和关联分析中广泛应用的分子标记。其中，SSR标记是根据基因组中微卫星两端的相对保 守序列设计的特异引物，PCR扩增稳定，检测技术简单且成熟，较适合用于分子标记基因定 位和辅助育种选择
[0006] 但是，现有技术中，抗赤霉病较好的品种，农艺性状不佳。而且由于不良基因连锁 的影响，直接用其与丰产性好的品种杂交，难以获得理想的抗赤霉病同时又丰产、优质小麦 新品种。因此，创造新的赤霉病抗源，对小麦抗赤霉病育种具有很重要的意义。科学家们在 小麦近缘物种中筛选，但一直没有突破性进展。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种可以鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗病性相关基因的SSR 分子标记引物及其用途和筛选方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供的远缘杂交小麦的SSR分子标记引物及其用 途和筛选方法是这样实现的：
[0009] -种远缘杂交小麦的SSR分子标记引物，所述引物包括Xssrpl9、Xssrp81、 Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl38、Xssrpl57 及 Xssrp201，各引物所对应的序列为：Xssrpl9 :正 向 ACATCATCAACTATGCCGAACA
[0010] 反向 CGCCTTTAGATCCCACCC
[0011] Xssrp81 :正向 CGAGGGTCAAACGCAAAG
[0012] 反向 ATCTCCGACGACGAGGGTG
[0013] Xssrp9I :正向 CTACTTTGCCGTGTTCTTCTC
[0014] 反向 GCCGTGGACTTCCATTTCT
[0015] Xssrp97 :正向 CTGAAAGGAGCAACATAT
[0016] 反向 TAAACAACCAAGGAAGAA
[0017] Xssrpl38 :正向 GGAGCGGAATGGATAAATAA
[0018] 反向 GGAAGGAAACGCAGGAGA
[0019] Xssrpl57 :正向 GTCGTGCTTGCGTTAGAT
[0020] 反向 GACTTGGAATGGAGGTTG
[0021] Xssrp201 :正向 TTGCCACGAAGTGATTGC
[0022] 反向 TTGGATGATGCCCTGACC。
[0023] 可选的，所述引物的退火温度分别为：
[0024] Xssrp 19 :55°C
[0025] Xssrp81 ：60°C
[0026] Xssrp91 ：50°C
[0027] Xssrp97 ：55〇C
[0028] Xssrpl38 ：50°C
[0029] Xssrpl57 ：55〇C
[0030] Xssrp201 :55°C。
[0031] 可选的，小麦的远缘品种是小黑麦。
[0032] 可选的，Xssrpl9、Xssrp81、Xssrpl38 位于染色体 7A 上，Xssrp91、Xssrp97、 Xssrpl57和Xssrpl38位于染色体3BS上。
[0033] SSR分子标记引物的筛选方法，包括：
[0034] A、从小麦远缘物种中确定赤霉病高感品种和赤霉病高抗品种；
[0035] B、通过小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种对201对SSR分子标记引物进 行多态性初步筛选；
[0036] C、通过小麦赤霉病高抗品种、普通小麦以及上述高抗品种与普通小麦的RIL株系 对初步筛选出的SSR分子标记引物进行多态性复筛，对复筛出的SSR分子标记引物进行分 子连锁图谱构建。
[0037] 可选的，所述的小麦远缘物种包括小黑麦、小偃麦和小赖麦。
[0038] 可选的，所述步骤A包括：（1)小麦开花时，采用单花滴注法进行赤霉病接种鉴定， 接种后21d，调查接种穗的病小穗数；用EXCEL计算每个品种的病情指数；参照江苏省农科 院制定的单花滴注接种等级划分标准进行等级划分；（2)同时对小麦进行室内毒素鉴定， 使用赤霉菌粗毒素处理小麦幼苗并计算根长抑制率、芽长抑制率和细胞损伤度，检测不同 品种小麦对于赤霉菌粗毒素的抗性；（3)根据间单花滴注赤霉病抗性鉴定和室内毒素鉴定 结果进行系统比较和相关性统计分析，确定赤霉病高抗品种和赤霉病高感品种；
[0039] 所述步骤B包括：提取赤霉病尚抗品种和赤霉病尚感品种各品种小麦的DNA ;分别 用201对SSR分子标记引物对上述各品种小麦的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分析，初 步筛选出具有多态性的SSR分子标记引物；
[0040] 所述步骤C包括：提取小麦赤霉病高抗品种、普通小麦以及上述高抗品种与普通 小麦的RIL株系各品种小麦的DNA ;分别用步骤B筛查出的SSR分子标记引物对上述各品 种小麦的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分析，复筛出具有多态性的SSR分子标记引物， 应用Joinmap4. 0软件构建其分子连锁图谱。
[0041] 可选的，所述 PCR 反应体系为：25ul，其中 10Xbuffer2. 5ul，25mMMg2+l. 5ul， 2. 5mMdNTPsO. 2ul，正向引物和反向引物各lul，Taq酶（5U/ul)0. 2ul，模板DNA2. 5ul，补水 至 25ul ;
[0042] 所述PCR扩增反应参数为94°C预变性5min后，94°C变性lmin，50~60°C退火 lmin, 72°C延伸lmin，循环34次，最后72°C延伸8min，在4°C下保存；
[0043] PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳完成后，凝胶用 0. 2%硝酸银溶液浸泡震荡IOmin后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透射仪上照相。
[0044] 可选的，所述PCR扩增使用仪器为在Biometra公司的Tl型PCR扩增仪。
[0045] SSR分子标记引物可用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性的相关基因。
[0046] 本发明提供的7对SSR引物，分别初步整合到已发表的分子遗传图谱上，可以增加 已有的分子标记密度，提高遗传图谱密度，有利于小麦抗赤霉病育种。
【附图说明】
[0047] 图1是本发明提供的P138作为引物的PCR扩增图；
[0048] 图2是本发明提供的P187作为引物的PCR扩增图；
[0049] 图3是本发明提供的7对SSR引物中Xssrp91作为引物的PCR扩增图；
[0050] 图4是本发明提供的7对SSR引物中Xssrp201作为引物的PCR扩增图；
[0051] 图5是本发明构建的小麦3BS染色体的遗传图谱连锁群；
[0052] 图6是本发明构建的小麦7A染色体的遗传图谱连锁群。
【具体实施方式】
[0053] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行 进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定 本发明。
[0054] 本发明提供的一种用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性相关基因的SSR分子标 记引物序列，所述引物序列如表二中 Xssrpl9、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl38、 Xssrpl57 及 Xssrp201 所不序列。
[0055] 上述用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性相关基因的SSR分子标记引物的筛选方 法包括如下步骤：
[0056] 步骤101、从小麦远缘物种中确定赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种；本实 施例采用的小麦远缘物种是二体异附加系小黑麦7个品种，小偃麦5个品种及小赖麦6个 品种（具体命名见表1)。
[0057] 该步骤通过如下方式实现：（一）上述各个品种小麦赤霉病抗性的鉴定：
[0058] (1)小麦开花时，采用单花滴注法进行赤霉病接种鉴定，接种后21d，调查接种穗 的病小穗数。用EXCEL计算每个品种的病情指数。参照江苏省农科院制定的单花滴注接种 等级划分标准进行等级划分；
[0059] (2)同时对小麦进行室内毒素鉴定，使用赤霉菌粗毒素处理小麦幼苗并计算根长 抑制率、芽长抑制率和细胞损伤度，检测不同品种小麦对于赤霉菌粗毒素的抗性；
[0060] (3)根据间单花滴注赤霉病抗性鉴定和室内毒素鉴定结果进行系统比较和相关性 统计分析。从中选出高抗池，高感池以进行下一步的发明。
[0061] 结果表明，在小偃麦类型、小黑麦类型、小赖麦类型这三个品种间的抗赤霉病行存 在显著差异：小黑麦类型的小麦品种基本都属于抗性品种（R型），只是存在高抗和抗的区 另IJ ;小赖麦类型的小麦品种基本都属于易感品种（S型），只是高感与感的区别；而小偃麦类 型的小麦品种抗性居中。说明黑麦是赤霉病的较好抗源，可与普通小麦构建群系用于初级 分子连锁图谱的构建。如表一所示，小麦品种及编制的代码表，从中选出BK B3、B5这3个 品种组成高抗池 ，CU C5、C6这3个品种组成高感池。
[0062] 表1小麦品种及编制的代码表
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[0065] 步骤102、提取小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种DNA ;
[0066] 用CTAB法分别提取高抗品种（BK B3、B5)、高感品种（CU C5、C6)各品种小麦的 DNA0
[0067]