快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物病毒的提取方法，具体涉及一种快速、简捷提取有活性的柑 桔黄化脉明病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 柑桔黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑桔黄 脉病是一种严重威胁柑桔生产的重要病害，主要分布于印度、巴基斯坦、土耳其等国，对柠 檬等柑桔品种造成了极其严重的损失。我国近年来在云南、四川等柠檬主产区也相继发现 了该病，其发生呈不断扩大、加重的趋势。
[0003] 目前除使用无病毒苗木和铲除病树外，尚无有效的防治方法。在开展防治柑桔黄 脉病的研究过程中，获得具有侵染能力的病毒颗粒是必不可少的重要环节。此外，获得大 量、有侵染能力的CYVCV颗粒，对研究该病毒的形态结构、物理特性、寄主范围、传播途径， 以及制备高性能的抗血清都有极其重要的意义。目前在提取病毒颗粒时主要采用的策略包 括差速离心、密度梯度离心、透析、免疫吸附等，但由于不同病毒的大小、结构、沉降系数、稳 定性等特性都存在差异，因此即使采用相同的提取策略，在缓冲液构成、病毒所在离心管中 的位置等重要提取条件上都是不相同的。虽然国外研究人员目前也曾尝试通过密度梯度离 心的方法提取CYVCV粒体，但此类方法均需要大量病株组织（约50~100g)，费时（耗时2 天以上），价格昂贵（需用到硫酸铯或氯化铯）。并且通过此类方法获得的CYVCV颗粒没有 侵染性，只能用于电镜观察（Loconsoleet al.，2012)。也有人尝试直接将寄主组织匀浆后 摩擦接种于柑桔，但该方法获得的病毒浓度低、侵染性减弱，只能侵染个别柑桔品种，且成 功率较低，也无法用于血清制备等后续研究（Alshamiet al.，2003)。这可能是由于CYVCV 不同于其它易于通过摩擦接种的草本植物病毒，因此接种方法的缺陷可能也会造成获得的 CYVCV提取物难以侵染柑桔。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种快速、简捷、高效的提取有活性的柑桔黄化脉明病毒 的方法。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：一种快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的 方法，包括如下步骤：
[0006] 1)取柑桔黄化脉明病病株组织5~IOg在液氮中研磨，研磨后按照重量/体积比 加入2~4倍体积的提取缓冲液进行匀浆；
[0007] 2)将步骤1)得到的匀浆液在冰上静置3~7min，用纱布过滤，将滤液4°C 3000~ 5000rpm离心15~25min后取上清，将上清液用Miracloth滤膜过滤，滤液倒入超速离心管 中，每管分装9mL滤液；
[0008] 3)在步骤2)中的离心管中从底部缓慢加入ImL蔗糖垫；
[0009] 4)将步骤3)中的离心管进行4°C 36000~40000rpm超速离心2~3h，离心结束 后用无菌针头在离心管底部扎小洞，用无菌离心管承接最初流出的1~I. 3mL溶液，即为粗 提液；
[0010] 5)将步骤4)得到的2个离心管中的粗提液倒入1个新的超速离心管中，并加 入提取缓冲液将总体积配至9mL，颠倒混匀后从离心管底部缓慢加入ImL蔗糖垫，进行 4°C 36000 ~40000rpm 超速离心 2 ~3h ;
[0011] 6)将步骤5)中的离心管用针头在离心管底部扎小洞，弃去最初流出的300 yL溶 液，并用无菌离心管承接随后流出的400 μ L病毒提取液，即得到有活性的柑桔黄化脉明病 毒，冰上放置备用；
[0012] 以上所述提取缓冲液为用pH 7. 440mM磷酸盐缓冲液配制的4~6% (w/v)的蔗 糖溶液，并且含有IOmM DTT ;以上所述蔗糖垫为用pH 7. 440mM磷酸盐缓冲液配制的65~ 75% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT;所述pH 7.440mM磷酸盐缓冲液用1(2即04、 KH2PC^P无菌水制得。
[0013] 作为优选地，所述步骤1)中的柑桔黄化脉明病病株组织为叶片或树皮。
[0014] 作为优选地，所述步骤1)中提取缓冲液的加入量为按照组织/缓冲液的重量/体 积比的3倍。
[0015] 作为优选地，所述提取缓冲液为用pH7. 4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的5 % (w/v) 的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT ;所述蔗糖垫为用pH7. 4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的70% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT ;所述pH7. 4、40mM的磷酸盐缓冲液每升含32. 08mL IM K2HP04、7. 921.01M KH2P04,用无菌水定容至 1L。
[0016] 作为优选地，所述步骤4)中用无菌离心管承接最初流出的粗提液，承接体积为 1.0 mL0
[0017] 所述步骤4)、5)中的超速离心转速为38000rpm，离心2h。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明方法中植株病组织的使用量较现有方法大大减少， 从现有方法的100g减少到5~IOg ;提取成本显著降低，用便宜、方便的蔗糖超速离心代 替了昂贵、复杂的硫酸铯密度梯度离心；并且提取时间大大缩短，从现有方法2天的提取时 间缩短至5h ;最为关键的是获得的病毒颗粒具有极高的侵染活性，能高效侵染多种柑桔品 种，可应用于制备高度专一的抗血清，致病性鉴定、病毒特性分析，以及抗性品种测定等，应 用范围广，对柑桔黄化脉明病毒的进一步研究具有极其重要的意义。
【附图说明】
[0019] 图1为用本发明方法提取、接种柑桔黄化脉明病毒植株的RT-PCR检测结果电泳条 带图；其中：1 :水对照，17 :负对照，18 :正对照，19 :100bp标准分子量，其余为接种植株的 检测结果。
[0020] 图2为采用方法E提取、接种柑桔黄化脉明病毒后表现脉明、黄化典型症状的植株 叶片；其中：图A为尤力克柠檬叶片，图B为温州蜜柑叶片，图C为代代酸橙叶片。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施案例对本发明作进一步的详细说明：
[0022] 主要试剂及生产者：
[0023] Miracloth 滤膜（Merck Millipore 公司，德国）
[0024] Sephadex G-50-80 构成的微柱（Sigma 公司，美国）
[0025] PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）
[0026] pMD19-T 载体（TaKaRa 公司，日本）
[0027] 感受态菌株JM-109 (TaKaRa公司，日本）
[0028] DIECA(二乙胺基二硫代甲酸钠）（上海生工生物工程有限公司，中国）
[0029] EDTA(乙二胺四乙酸）（上海生工生物工程有限公司，中国）
[0030] DTT (二硫苏糖醇）（上海生工生物工程有限公司，中国）
[0031] Triton X-100 (上海生工生物工程有限公司，中国）
[0032] Tris (三羟甲基氨基甲烷）（上海生工生物工程有限公司，中国）
[0033] SDS (十二烷基硫酸钠）（上海生工生物工程有限公司，中国）
[0034] TES 缓冲液（1M Tris-HCl 50mL，0. 5M EDTA2mL，SDS 10g，用水定容至 500mL， ρΗ8· 0,高温灭菌后保存）
[0035] 本发明实施例中所用提取缓冲液为用ρΗ7. 4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的5% (w/ v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT。所用蔗糖垫为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的 70% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT。pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液每升用32.08mL IM K2HP04,7 . 92mL IM KH2P04 和无菌水配得。
[0036] 实施例1柑桔黄化脉明病毒的提取
[0037] 提取柑桔黄化脉明病毒，按照如下步骤操作：
[0038] 1)将5~IOg柑桔黄化脉明病病株的叶片或树皮（植株来源于西南大学柑桔研究 所毒源库）在液氮中研磨成粉状转移至一干净的无菌50mL离心管中，并按重量/体积比加 入3倍体积（即Ig病株组织加入3mL提取缓冲液）的提取缓冲液进行匀浆。
[0039] 2)匀浆后将离心管在冰上静置5min，将混液经三层纱布进行过滤，将滤液进行 4°C 5000rpm离心20min，获得的上清液经Mira cloth滤膜过滤后，倒入IOmL超速离心管 中，每管加入9mL上清液，不足9mL时用提取缓冲液进行补充。
[0040] 3)随后用ImL微量注射器在超速离心管的底部缓慢的加入ImL蔗糖垫。注意该过 程不能发生抖动或产生气泡。
[0041] 4)将步骤3)的离心管用美国Beckman公司的SW40Ti超离转头进行4°C 38000rpm 超速离心2h。离心结束后，用无菌针头在离心管底部扎一小洞，用一无菌的I. 5mL离心管承 接最初流出的1.0 mL溶液，即为粗提液。
[0042] 5)将步骤4)得到的2个无菌I. 5mL离心管中的粗提液倒入1个新的IOmL超速离 心管中，并加入提取缓冲液，将总体积配至9mL (整个转移过程不得使用移液器）。颠倒混匀 后，再用ImL微量注射器在超速离心管的底部缓慢加入ImL蔗糖垫。随后使用SW40Ti超离 转头进行4°C 38000rpm超速离心2h。
[0043] 6)超速离心结束后，用针头在离心管底部扎一小洞，弃去最初流出的300 yL溶 液，并用无菌离心管承接随后流出的400 μ L病毒提取液，冰上放置备用。
[0044] 实施例2柑桔黄化脉明病毒的接种
[0045] 接种实施例1中提取得到的柑桔黄化脉明病毒，操作步骤如下：
[0046] 1)用无菌手术刀在无病毒的尤力克梓檬植株上划开3~5处大小为0· 3cmX 5cm， 且深至韧皮部的伤口，该伤口处的皮仍需保留。
[0047] 2)用削了头的无菌枪头在每个伤口处滴加10 μ L实施例1中提取得到的柑桔黄化 脉明病毒提取液，使得该提取液充分润湿伤口处的韧皮部及其相应皮的内侧。将伤口处原 有的皮盖住伤口后并用嫁接薄膜将伤口绑紧