一种富含甾醇的热带假丝酵母的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种富含留醇的热带假丝酵母的培养方法。
【背景技术】
[0002]留醇是留族化合物中的一种，分子的基本骨架(称为环戊烷多氢菲核)有三个六元环和一个五元环组成。C-3位上连有一个轻基，C-17位连有由8?10个碳原子构成的侧链，多数留醇C-5位为双键。由于C-17位上的侧链不同和C-3位上羟基结合的物质不同，甾醇的种类也不同。
[0003]留醇是生物体内天然有机化合物，广泛存在于动物、植物、微生物的组织中。在动物组织中以胆留醇(又称胆固醇)为主；在植物组织(主要是种子)中，主要是谷甾醇、豆甾醇和菜油留醇；在微生物中主要是麦角留醇。因此，胆留醇被称为动物留醇；β-谷甾醇、豆留醇和菜油留醇被称为植物留醇；麦角留醇被称为微生物留醇。植物留醇主要来源于植物油，其含量仅为0.04%?0.1%。由于留醇是真核生物细胞膜的组成成分，因此，所有的真核生物均含有留醇，但留醇的种类及其含量有很大的差别，其中酵母菌属中酿酒酵母的甾醇较为丰富。酿酒酵母可以合成约20种留醇，留醇总含量最大为4.6% (细胞干重)，其中麦角甾醇占总甾醇的90%。
[0004]留醇被誉为“生命的钥匙”，具有十分重要的生理功能。谷留醇、豆留醇和菜油甾醇具有降血清胆固醇、降血脂、抗肿瘤、降低心脏病发生率、防止前列腺疾病，以及抗癌、调节动物的生长、抗炎、抗病毒、延缓衰老等作用。β-谷留醇、豆留醇、菜油留醇和麦角甾醇也是多种激素、维生素D及留族化合物合成的前体。因此，留醇广泛应用于食品、医药、化妆品等工业领域。
[0005]申请号为95114213.5的中国专利公开了一种富含麦角甾醇酵母的制造方法，培养基中以糖蜜为碳源，培养基组分还包含适量的尿素、硫酸铵、磷酸等来发酵培养酵母菌，所得的酵母细胞中麦角留醇含量可达到1.4%?1.6%。申请号为201080055130.5的中国专利公开了一种通过酵母生产非酵母的留醇的制造方法，所使用的酵母可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酉孝母(Pichia spp)、克鲁维酉孝母(Klyuveromycesspp)，汉逊酵母(Hansenula spp)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spec.)和解脂酵母(Yarrowia Iipolytica),所生产的留醇为7_脱氢胆固醇、25-轻基-7-脱氢胆固醇和25-羟基麦角留醇。以脂肪酸为碳源发酵培养富含留醇的热带假丝酵母的方法在国内外文献中均未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种富含留醇的热带假丝酵母培养方法，所收获的热带假丝酵母细胞富含留醇，其留醇含量可达到6.23%?7.12%，而且所产生的留醇以谷甾醇和菜油留醇为主。
[0007]本发明的原理:热带假丝酵母具有能以游离脂肪酸和油脂作为碳源进行生长繁殖的特性。制备以游离脂肪酸或脂肪为唯一碳源的培养基；培养基经过高温灭菌、冷却后，接种热带假丝酵母进行通气好氧发酵；发酵结束后，离心收集菌体，即获得富含留醇的热带假丝酵母细胞。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实施:
[0009]—种富含甾醇的热带假丝酵母的培养方法，包括以下步骤:
[0010]a、种子培养基的配制及灭菌:按配比在IL水中，加入20?30g葡萄糖、10?20g蛋白胨、5?1g酵母粉，按照所述配比，将各种成分称重后加入三角瓶中，室温下搅拌均匀，制得种子培养基；用8层纱布密封后放入高压灭菌锅中，于115°C?121°C灭菌15?20min，灭菌后把三角瓶冷却至室温；
[0011]b、种子液的制备:挑取热带假丝酵母的斜面保藏菌种2?3环，接种到步骤a中所述的种子培养基中，于30°C、180?200rpm摇床振荡培养48h，备用；
[0012]C、发酵培养基的配制及灭菌:于IL水中，加入40?50g游离脂肪酸或油脂(所述油脂为大豆油、花生油、菜籽油、棉籽油等)、1.0?2.0g酵母粉、0.1?0.2g硫酸镁、0.1?
0.2g磷酸氢二钾、0.1?0.2g磷酸二氢钾；按照所述配比，将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，室温下搅拌均匀，并用0.5M氢氧化钠溶液调节pH值6.8?7.0，制得发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到115°C?121°C，保温30min，灭菌结束后，引入冷却水将发酵培养基温度降至25°C?30°C ;
[0013]d、发酵:将步骤b所述热带假丝酵母菌种子液以8%?10%接种量接种到步骤c所述发酵罐中的培养基之中，控制发酵温度28°C?30 °C，机械搅拌转速220rpm?240rpm，通气量1.0?1.2vvm, pH值6.8?7.0,发酵96?108h。
[0014]e、离心、洗涤:将步骤d所述的发酵液放置于离心机中，5000?5500rpm离心15?20min，弃上层残存的游离脂肪酸或油脂及清液，收集沉淀在离心机底部的菌泥(湿菌体)，按照1:50?1:80的比例加入50°C?60°C去离子水制成菌悬液，搅拌5?8min，然后再次进行离心，如此洗涤3次，得到热带假丝酵母湿菌体；
[0015]f、干燥:将步骤e所述的热带假丝酵母湿菌体进行40°C?50°C冷风干燥，即获得富含留醇的热带假丝酵母干菌体。
[0016]所述步骤f中，其总甾醇含量为6.23%?7.12%。其中谷甾醇占总甾醇的53.4%;菜油甾醇占总甾醇的37.9%。
[0017]优选的，所述步骤a中种子培养基的物质组成为:20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母粉。
[0018]优选的，所述步骤c中发酵培养基的组成为:于IL水中，加入50g大豆油、2.0g酵母粉、0.1g硫酸镁、0.1g磷酸氢二钾、0.1g磷酸二氢钾。
[0019]优选的，所述步骤c中油脂为大豆油、花生油、菜籽油、棉籽油中的一种。
[0020]优选的，一种富含甾醇的热带假丝酵母的培养方法，包括以下具体步骤:
[0021]a、种子培养基的配制及灭菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、1g蛋白胨、5g酵母粉，按照所述配比，将各种成分称重后加入三角瓶中，室温下搅拌均匀，制得种子培养基；用8层纱布密封后放入高压灭菌锅中，121°C灭菌20min，灭菌后把三角瓶冷却至室温；
[0022]b、种子液的制备:挑取热带假丝酵母的斜面保藏菌种2?3环，接种到步骤a中所述的种子培养基中，30°C、200rpm摇床振荡培养48h ；
[0023]c、发酵培养基的配制及灭菌:于IL水中，加入50g大豆油、2.0g酵母粉、0.1g硫酸镁、0.1g磷酸氢二钾、0.1g磷酸二氢钾，按照所述配比，将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，室温下搅拌均匀，并用0.5M氢氧化钠溶液调节pH值7.0，制得发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到121°C，保温30min，灭菌结束后，引入冷却水将发酵培养基温度降至25°C?30°C ;
[0024]d、发酵:将步骤b所述热带假丝酵母菌种子液以10%接种量接种到步骤c所述发酵罐中的培养基之中，控制发酵温度30°C，机械搅拌转速240rpm，通气量1.2vvm, pH值7.0,发酵108h ；
[0025]e、离心、洗涤:将步骤d所述的发酵液放置于离心机中，5500rpm离心20min，弃上层残存的大豆油及清液。收集沉淀在离心机底部的菌泥(湿菌体)，按照1:80的比例加入60°C去离子水制成菌悬液，搅拌5?8min，然后再次进行离心，如此洗涤3次，得到热带假丝酵母湿菌体；
[0026]f、干燥:将步骤e所述的热带假丝酵母湿菌体进行40°C?50°C冷风干燥，即获得富含留醇的热带假丝酵母干菌体。
[0027]所述步骤f中，其总甾醇含量为6.95%，在所产生的总甾醇中，谷甾醇占53.4%，菜油甾醇占37.9%。
[0028]本发明与现有技术相比具有的有益效果为:
[0029]①所获得的热带假丝酵母细胞留醇含量达到6.23%?7.12%，远远高于普
[0030]通方法所培养的酵母细胞中的留醇含量(1.4%?4.6% )。
[0031]②所获得的热带假丝酵母细胞所产生的留醇以谷留醇和菜油留醇为主，而普通方法所培养的酵母细胞中的甾醇以麦角甾醇为主。同麦角甾醇相比，谷甾醇和菜油甾醇用途更加广泛。
[0032]③采用微生物发酵大量产生植物留醇:谷留醇和菜油甾醇。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0034]实施例一
[0035]富含留醇的热带假丝酵母培养方法:以油酸为唯一碳源。
[0036]a、种子培养基的配制及灭菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、1g蛋白胨、1g酵母粉。按照所述配比，将各种成分称重后加入三角瓶中，室温下搅拌均匀，制得种子培养基；用8层纱布密封后放入高压灭菌锅中，115°C灭菌15min。灭菌后把三角瓶冷却至室温。
[0037]b、种子液的制备:挑取热带假丝酵母的斜面保藏菌种2?3环，接种到步骤a中所述的种子培养基中，30°C、200rpm摇床振荡培养48h。
[0038]C、发酵培养基的配制及灭菌:于IL水中，加入40g油酸、2.0g酵母粉、0.1g硫酸镁、0.1g磷酸氢二钾、0.1g磷酸二氢钾。按照所述配比，将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，室温下搅拌均匀，并用0.5M氢氧化钠溶液调节pH值7.0，制得发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到121°C，保温30min，灭菌结束后，引入冷却水将发酵培养基温度降至25°C?30°C。
[0039]d、发酵:将步骤b所述热带假丝酵母菌种子液以10%接种量接种到步骤c所述发酵罐中的培养基之中，控制发酵温度30°C，机械搅拌转速220rpm，通气量1.2vvm, pH值7.0,发酵108h。
[0040]e、离心、洗涤:将步骤d所述的发酵液放置于离心机中，5000rpm离心20