分子量标准物被引入到本文提供的系统和设备中。在某些实施例中，分子量标准物是阶梯标准物，所述阶梯标准物当显现时沿着毛细管示出不同的分子量。在电泳期间迀移的样本中的蛋白质与阶梯相比较以确定存在于样本中的蛋白质的重量。在一个实施例中，使用多个分子量阶梯标准物。
[0058]电泳标准物可以被合成以呈现出广泛范围的特征和/或迀移率。在某些实施例中，电泳标准物具有在约20道尔顿(Da)至约800千道尔顿(kDa)的范围内的分子量。电泳标准物通常包括能够影响电泳迀移率、能够检测和/或能够使标准物固定的一个或多个部分。例如，电泳标准物可以包括能够通过将标准物共价链接到基底而使标准物固定的一个或多个部分。一个或多个部分可以包括例如构造成呈现出和/或执行所需功能的一个或多个官能团。
[0059]在一个实施例中，上述的分析物和/或标准物通过任何物理特征分离，所述任何物理特征包括但不限于它们的尺寸(例如，分子量，寡核苷酸长度)。例如，在一个实施例中，在本文所述的设备和系统中，基于样本中的分子的尺寸，样本在包括分离基质的毛细管中经受电泳分离。
[0060]如贯穿全文所提供的，本发明涉及分解一个或多个分析物，其包括对存在于本文所述的设备和系统中的毛细管中的样本电泳。本文所述的方法、系统和设备构造成以串联或平行的方式以自动化的形式对存在于一个或多个毛细管中的一个或多个样本执行毛细管电泳。
[0061]毛细管包括分离基质，所述分离基质可以通过设备和/或系统以自动化的形式添加。在一个实施例中，分离基质是尺寸分离基质并且具有与用在传统电泳实验中的聚合物凝胶类似的或基本相同的性能。在分离基质中的毛细管电泳类似于聚合物凝胶中的分离，所述聚合物凝胶例如是聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶，其中分子通过提供可以供分子行进通过的多孔通路基于样本中的分子的尺寸来分离。因为较大的分子将比较小的分子更为缓慢地通过基质行进，基质分离容许分子通过分子尺寸来分离。
[0062]在一个实施例中，一旦分离完成，分离的样本的组分(例如，包括分析物和/或标准物)使用任何适当的方法被固定到毛细管的一个或多个壁，所述任何适当的方法包括但不限于化学、光化学和热处理。在某些实施例中，分离的样本的组分在分子已经通过电泳分离之后被固定在流体路径(例如，由毛细管或类似物限定的流体路径)中。例如，在一个实施例中，通过使分离的样本和毛细管经受紫外(UV)光而发生固定，所述紫外(UV)光用于使样本中的一个或多个分析物(如果存在于样本中的话)和分子固定到毛细管的壁。固定可以经由共价键或经由诸如疏水性或离子相互作用的非共价手段来实现。在另一个实施例中，反应性部分可以用于使已分解的一个或多个分析物共价地固定在流体路径中。反应性部分可以被直接地或间接地附装到流体路径(例如，在毛细管的一个或多个壁上)。在某些实施例中，反应性部分可以被供给在溶液或悬浮液中，并且可以构造成在激活时在流体路径的壁和样本中的分子之间形成桥。反应性部分可以在流体路径中排成行或可以在流体路径中存在于线性的或交联的聚合物上，所述线性的或交联的聚合物在激活之前和/或之后可以或可以不链接到流体路径的壁。反应性部分可以是和/或可以包括任何能够与样本的各个分子的相对应的反应基形成共价键的反应基，例如，上述的那些。
[0063]在某些实施例中，反应性部分包括官能团，所述官能团可以经由疏水作用、离子相互作用、氢键结合等转换为粘附到分析物的功能性。在某些实施例中，这样的反应性部分借助UV光、激光、温度或任何其它能源激活，以便使分析物固定到流体路径的表面上和/或固定到附着到流体路径的表面的粒子的表面上。在某些实施例中，流体路径的表面借助热响应聚合物而功能化，所述热响应聚合物在改变温度时改变表面的疏水性。在某些实施例中，分析物通过当流体路径内达到一定温度时增大温度响应聚合物的疏水性而固定在这样的表面上。
[0064]固定的分析物和/或标准物继而被探查以用于一个或多个探测剂并且借助一个或多个探测剂检测。探测剂能够结合到待检测的分析物和/或标准物或与待检测的分析物和/或标准物相互作用。探测剂允许通过任何措施检测标准物和分析物，所述任何措施例如但不限于一个或多个荧光染料，一个或多个光学染料，一个或多个化学发光试剂，放射性，粒子，一个或多个磁性粒子，一个或多个顺磁性粒子，等等。探测剂可以包括任何有机或无机分子，例如，蛋白质，缩氨酸，抗体，酶底物，过渡态类似物，辅因子，核苷酸，核苷酸，核酸适配体，外源凝集素，小分子，配体，抑制剂，药物和其它生物分子以及能够结合待检测的分析物的非生物分子。在某些实施例中，探测剂包括一个或多个标签部分(如上所述)。在某些实施例中，探测剂包括一个或多个标签部分。在采用两个或更多个标签部分的实施例中，每个标签部分都可以是相同的，或标签部分中的某些或全部可以不同。
[0065]在一个实施例中，探测剂用作二级试剂。例如，在一个实施例中，探测剂被设计成结合第一分子，所述第一分子被引入以结合到分析物和/或标准物，或结合第一分子与分析物和/或标准物的复合物。例如，在一个实施例中，“初级”单克隆或多克隆抗体首先被引入到包括固定的样本的毛细管中。该“初级”抗体结合到感兴趣的分析物(如果存在于样本中的话)并且已自由的初级抗体被冲走了。接下来，“二级”抗体被引入，所述“二级”抗体被设计成结合初级抗体或跨越初级抗体分析物复合物的区域。二级抗体包括用于检测感兴趣的分析物的存在/缺乏和/或使感兴趣的分析物的存在/缺乏可视化的标签部分。
[0066]在一个实施例中，在本文提供的设备和系统中执行多重免疫分析以检测样本中的两个或更多个感兴趣的分析物(例如，两个、三个、四个或五个分析物)的存在或缺乏或者量化样本中的两个或更多个分析物的量。在又一个实施例中，探测剂对于感兴趣的分析物中的每个都是相同的。例如，用于每个分析物的探测剂是偶联到诸如辣根过氧化物酶的化学发光标签的二级抗体。分析物之间的分化通过最初将不同的初级抗体引入到毛细管中而发生，其中每个初级抗体都特地用于独特的感兴趣的分析物。
[0067]偶联到二级抗体的标签部分可以是任何适当的标签。例如，一般的标签可以包括光学染料(例如，有色染料或荧光染料)；化学发光标签，磷光标签，酶标签(例如，碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶)，生物发光标记，同位素标签(例如，放射性同位素或重同位素)，质量标签和/或穗型标签(例如，胶体、磁性粒子，等等)。在一个实施例中，标签部分是化学发光部分。在另一个实施例中，化学发光部分是辣根过氧化物酶(HRP)。在一个实施例中，HRP被偶联到二级抗体并且在免疫测定中使用以检测样本中的一个或多个分析物。在某些实施例中，标签部分可以是单个同分异构体染料。在某些实施例中，标签部分可以是荧光染料，所述荧光染料可以包括提供荧光信号的任何实体。例如，荧光染料可以包括共振离域系统或芳香环系统，其吸收第一波长的光并且响应于吸收事件发射第二波长的荧光。荧光染料可以是各种类别的荧光化合物中的任一个，例如，氧杂蒽，若丹明，荧光素，青色素，酞菁，方酸菁，氟硼荧染料，香豆素，恶嗪染料和碳红。在某些实施例中，荧光染料是5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)和/或任何其它适当类别的荧光化合物。
[0068]在某些实施例中，标签部分可以是并且/或者可以包括化学发光标签。适当的标签部分可以包括这样的酶，即，所述酶能够以通过化学发光诱导光子发射的方式与化学发光基底反应。例如，酶可以通过酶活性在其它分子中诱导化学发光。这样的酶可以是并且/或者可以包括过氧物酶，例如，辣根过氧化物酶(HRP)，β-半乳糖苷酶，磷酸酶，等等。在某些实施例中，化学发光标签可以从各种类别的鲁米诺标签、异鲁米诺标签等中的任一个选出。在某些实施例中，探测剂可以包括化学发光标记的抗体，例如，共价结合到HRP的二级抗体。在某些实施例中，探测剂包括化学发光基底，例如，可从加利福尼亚州福斯特市的美国应用生物系统公司得到的Galacton基底或可从伊利诺斯州罗克福德市的皮尔斯生物技术公司得到的SuperSignai West Femto Maximum Sensitivity基底或任何其它适当的基底。在某些实施例中，探测剂可以是在美国专利N0.6，689，576，N0.6，395，503，N0.6，087，188，N0.6，287，767，N0.6，165，800和N0.6，126，870中说明的那些中的任一个，这些美国专利的全部公开内容由此通过参考包含于此。
[0069]在某些实施例中，标签部分可以是并且/或者可以包括生物发光化合物(例如，在其中催化蛋白提高化学发光反应的效率的生物系统中发现)。生物发光化合物的存在通过检测发冷光的存在来确定。适当的生物发光化合物包括，但不限于，荧光素，荧光素酶和水母素。
[0070]在一个实施例中，标签部分可以是并且/或者可以包括荧光染料。这样的荧光染料可以包括共振离域系统或芳香环系统，其吸收第一波长的光并且响应于吸收事件发射第二波长的荧光。荧光染料可以是各种类别的荧光化合物中的任一个，例如，但不限于，氧杂蒽，若丹明，荧光素，青色素，酞菁，方酸菁，氟硼荧染料，香豆素，恶嗪染料和碳红。在例如其中探测剂含有诸如荧光染料的荧光素的某些实施例中，探测剂的荧光性通过用合适的光源激发探测剂并且通过由检测器监测它们的荧光性来检测，所述检测器对探测剂的特征荧光发射波长敏感。
[0071]如先前所述的，在一个实施例中，两个或更多个不同的药剂可以用于结合到两个或更多个不同的分析物或与两个或更多个不同的分析物相互作用以能够同时地检测多于一个类型的分析物。在某些实施例中，结合到一个分析物或与一个分析物相互作用的两个或更多个不同的探测剂可以被同时地检测。在各实施例中，使用两个或更多个不同的探测剂，一个药剂例如第一初级抗体可以结合到一个或多个分析物或与一个或多个分析物相互作用以形成第一药剂分析物复合物，并且第二试剂，探测剂例如二级抗体可以用于结合到第一药剂分析物复合物或与第一药剂分析物复合物相互作用。
[0072]在另一个实施例中，两个不同的探测剂，例如用于感兴趣的分析物的含磷和不含磷两种形式的抗体，可以实现检测两种形式的感兴趣的分析物。在某些实施例中，单个特定的探测剂，例如抗体，可以允许检测和分析磷酸化和非磷酸化两种形式的分析物。在某些实施例中，多个探测剂可以供多个基底使用以提供彩色复用。例如，不同的化学发光基底可以用于发射不同颜色的光子。不同颜色的选择检测(例如，经由衍射光栅，一个或多个棱镜，一系列滤色器和/或类似物)可以允许确定在沿着流体路径(例如，沿着尺寸梯度)的任何位置处发射哪种颜色的光子，并且因此确定在每个发射位置处存在哪个探测剂。在某些实施例中，不同的化学发光试剂可以被顺序地供给，允许顺序地检测不同的已结合的探测剂。
[0073]通常，在本文所述的设备和系统中所执行的标准物免疫测定处理期间，内部标准物的部分将由于各种清洗处理而损失。因而，通常期望的是在化验开始时将足够量的内部标准物装载在样本中，以便可以由在免疫测定之后保持在毛细管中的内部标准物产生足够的信号以提供协调来校准曲线和分析分析物的尺寸和/或个性(例如，氨基酸数目或寡核苷酸碱基对数目)。然而，如果标准物和分析物位于相同的位置中，则较大量的内部标准物可以与分析物的捕获物相互作用。照此，某些标准物在电泳期间和/或在电泳结束时不与分析物布置在一起。然而，这种标准物会不产生可靠的校准曲线以用于检测分析物。因此，在某些实施例中，样本可以包括多于一个的标准物。例如，内部标准物可以通过第一标准物形成并且/或者包括第一标准物(称为“明亮标准物”或“注册标准物”)和第二标准物(称为“模糊标准”)。明亮标准物可以是具有与分析物的特征不同的特征(例如，分子量范围或特定分子量)的标准物。照此，在电泳之后，注册标准物和分析物的位置彼此远离地位于毛细管中。因而，从明亮标准物和分析物发射的荧光将不重叠并且彼此不相互作用。模糊标准物可以是具有与分析物的特征类似的特征(例如，分子量范围或特定分子量)的标准物。照此，在电泳之后，注册标准物和分析物的位置彼此接近地位于毛细管中。
[0074]明亮标准物可以位于沿着流动路径(例如，由毛细管或类似物限定的流动路径)的、与分析物的位置不同的位置处并且提供协调(例如，锚定点)以用于使模糊标准物位于靠近分析物的位置处或与分析物相同的位置处，由此提供准确的校准曲线。通常，明亮标准物产生比在内部标准物和分析物已经分离和固定之后由模糊标准物发射的荧光更亮的荧光。在明亮标准物和模糊标准物之间的亮度的差异可以归因于在发射的性质中的不同和/或在包含在内部标准物中的两个标准物的量的不同。例如，较大量的明亮标准物和较小量的模糊标准物可以被混合以形成可以产生来自于明亮标准物的“明亮”信号和来自于模糊标准物的“模糊”信号的标准物。因而，在通过电泳执行的分离步骤之后检测由于明亮标准物所产生的“明亮”信号和由于模糊信号所产生的“模糊”信号。在某些实施例中，内部标准物可以包括例如在美国专利申请公开N0.2011/0011740中说明的那些的明亮标准物和模糊标准物，所述美国专利申请的整个公开内容由此通过参考包含于此。
[0075]本文所述的实施例可以与上述的化学和/或方法中的任何结合使用。例如，图1是根据实施例的毛细管电泳系统100的部分的示意图。毛细管电泳系统100(在此也称为“系统”)构造成帮助在单个系统中分析目标分析物并且提供移液管和流体路径二者的功能，由此能够分析非常小体积的样本。系统100可以包括任何适当的装置、机构、组件、子组件、电子装置、致动器和/或类似物(图1中未示出)，其能够使系统100例如分离、固定和检测任何适当的目标分析物。
[0076]如图1中所示，系统100可以构造成接收和/或包括盒150。盒150包括本体部分151，所述本体部分151被固定地联接到一组基本柔性的毛细管153。盒150的本体部分151限定储器152。更具体地，本体部分151布置成使得联接到该本体部分151的一组毛细管153与储器152流体连通。例如，在某些实施例中，本体部分151可以是基本中空的，在一组壁(图1中未示出)之间限定储器152。类似地阐述，本体部分151可以由一组壁限界，所述一组壁从基部(图1中未示出)延伸以限定储器152，而同时允许本体部分151的至少一个侧保持基本打开(例如，本体部分151可以具有或限定基本U状的横截面)。如本文进一步详细地说明的，本体部分151的至少一部分可以是导电的。换言之，本体部分151的至少一部分可以由导电塑料或导电聚合物形成。在某些实施例中，导电塑料包括碳注入塑料。在其它实施例中，导电塑料包括不锈钢注入塑料，碳纳米管注入塑料，等等。
[0077]在某些实施例中，微孔板塑料具有〈25欧姆.厘米的电阻率(体积)和le3至le5欧姆的电阻率(表面)，并且盒顶部具有<le3欧姆.厘米的电阻率(体积)和<le6欧姆的电阻率(表面)。
[0078]—组二十五个毛细管具有I兆欧姆至2兆欧姆的总电阻率。在某些实施例中，例如，微孔板的电阻率比毛细管的电阻率(即，20千欧姆或更小)低了至少2个数量级。在某些实施例中，电阻率是较低的。例如，在具有100个毛细管的盒的实施例中，总电阻率将是25百分比或250千欧姆至500千欧姆。在其它实施例中，微孔板的电阻率是较高的。
[0079]如果导电部件的电阻率高于某一阈值(例如，比毛细管的电阻率小100倍)，则横过导电部件有电压降，并且需要来自于电源的更高电压达到毛细管中的相同的电压。换言之，
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[0080]—组毛细管153可以是任何适当的布置。例如，虽然盒150在图1中示出为包括一组七个单独的毛细管153，但是在其它实施例中，盒可以包括任何数目的单独的毛细管。例如，在某些实施例中，盒可以包括少于七个的单独的毛细管或多于七个的单独的毛细管。在某些实施例中，盒可以包括25个或更多的单独的毛细管。毛细管153限定管腔(图1中未示出)，所述管腔可以构造成接收样本、溶液、试剂、分析物和/或任何其它适当的流体或凝胶的至少一部分，如本文进一步详细地说明的。
[0081]毛细管153可以是任何适当的形状、尺寸或构型，并且可以由允许液体和/或溶解分子流动的任何适当的材料(例如，玻璃、塑料、硅胶、熔融石英、凝胶、PYREX?(非晶玻璃)和/或类似物)形成。在某些实施例中，毛细管153的长度可以至少部分基于以下因素，例如，对于分解感兴趣的一个或多个分析物所需的样本分离的程度和样本尺寸。在某些实施例中，毛细管153可以具有约2厘米(cm)至20厘米(cm)的长度。在某些实施例中，毛细管153可以具有小于2cm的长度。在某些实施例中，毛细管153可以具有约3cm、4cm、5cm或6cm或更长的长度。在某些实施例中，较长的毛细管153的使用可以促使较好的样本分离和改进的复杂混合物的分辨率和/或何时分解较低丰度的分析物。在某些实施例中，毛细管可以具有较小的内径。
[0082]在某些实施例中，毛细管153可以是基本圆筒形的，其具有任何适当的长度和任何适当的直径。因此，由毛细管153限定的管腔的形状和/或尺寸可以与毛细管153的形状和/或尺寸基本相对应。例如，在某些实施例中，毛细管153可以限定具有约10微米(μπι)至约ΙΟΟΟμπι的直径的管腔。在其它实施例中，盒可以包括这样的毛细管，S卩，所述毛细管限定具有约25μπι至约400μπι的