。将运一过程总计重复6次。稀释的系列为1、4、16、 64、256、1024、4096倍。
[0206] (2-5)抗原抗体反应
[0207] 分别准备对49〇6、49〇41八3、7^、因子山〇-2-1进行测定的分析用96孔过滤板和对 C4进行测定的分析用96孔过滤板，进行抗原抗体反应。
[0208] 在分析用96孔过滤板中加入200μ1的洗涂缓冲液，使用平板振荡器(Μ · BR-022, TAITEC公司），W1，2(K)rpm在室溫下揽拌10分钟。然后，使用歧管，抽滤除去洗涂缓冲液。在 所使用的全部孔中加入25μ1的分析缓冲液，再加入25μ1的珠稀释液。接下来，在分析样品用 孔、标准样品用孔、QC样品用孔、背景测定用孔中加入25μ1的各样品。在背景测定用孔中加 入分析缓冲液。将板密封后，用平板振荡器进行抗原抗体反应。ΑροΕ、ΑροΑ1、C3、TTR、因子Η、 α-2-Μ测定用板在室溫下进行2小时抗原抗体反应。C4测定用板在4 °C下进行16小时抗原抗 体反应。
[0209] (2-6)清洗W及测定
[0210] 抗原抗体反应后，抽滤除去溶液，再加入20化1的洗涂缓冲液，将抽滤除去重复3 次，进行珠的清洗。清洗后，在所使用的全部孔中加入25μ1的检测抗体，将板密封，用平板振 荡器在室溫下揽拌1小时，进行二次抗体反应。反应后，加入25μ1的链霉亲和素-藻红蛋白， 进行密封，用平板振荡器在室溫下揽拌30分钟。反应后，抽滤除去溶液，再加入20化1的洗涂 缓冲液，将抽滤除去重复3次，进行珠的清洗。在各孔中加入10化1的銷液，在室溫下揽拌5分 钟后，通过Luminex 200?化皿inex Corp. ,USA)进行巧光测定。血清样品中的标记物的定量 解析是使用通过χΡΟΝΕΝΤ 3.1软件化uminex Co巧.，USA)、由标准样品求出的标准曲线的计 算式进行定量。
[0211] (3)结果
[0212] 对所检测的标记物蛋白质在NDC群、MCI群、AD群间血清中的存在量是否存在差异 进行差异解析。表1是通过2对t检定对各症例群进行检定，给出显著水平为p<0.05时的P值。 补体C3(C3)在NDC和MCI的对比、NDC和AD的对比、MCI和AD的对比中均有显著差异，可知对将 认知功能障碍疾病(MCI、AD)患者与非认知功能障碍(NDC)患者相区分是有用的。另外，可知 载脂蛋白Al(ApoAl)、甲状腺素运载蛋白（TTR)对将AD患者区分于NDC是有用的。载脂蛋白E (ApoE)、补体因子Η(因子H)、α-2-巨球蛋白（α-2-Μ)、补体C4(C4)在任一疾病组都不显示显 著差异。
[0213] 为了对所检测的标记物蛋白质的有用性达到何种程度进行评价，通过受试者操作 特性曲线（receiver operating characteristic curve,R0C曲线）进行分析。R0C曲线的下 部的面积值(R0C的AUCKW下称为AUC)越接近1，作为生物标记物的有用性越高。制作MC巧口 NDC、AD和NDC的比较中的R0C曲线，对显示AUC在0.6 W上的标记物蛋白质进行解析，结果发 现C3、ApoAl、TTR显示AUC在0.6 W 上。表2 中给出 C3、ApoAl、TTR 的 NDC 和MCI、NDC 和AD 的 AUC。 [0214]图1、图2、图3给出C3、ApoAl、TTR运3个标记物蛋白质的差异解析和R0C曲线。图1的 A)是差异解析图，通过NDC和MCI进行比较时，MCI中C3显著减少(t检定、P值0.034)，通过NDC 和AD进行比较时，AD中C3显著减少（t检定、p值1.668E-4)。进而，通过MCI和AD进行比较时， AD中C3显著减少(t检定、P值0.01)。图1的B似及C)是通过NDC和MCI、NDC和AD进行比较时的 ROC曲线。通过NDC和MCI进行比较时的AUC为0.663，通过NDC和AD进行比较时的AUC为0.834。 图2的A)是ApoAl的差异解析图，通过NDC和AD进行比较时，AD中C3显著减少（t检定、P值 0.049)。图2的B)W及C)是通过NDC和MCI、NDC和AD进行比较时的R0C曲线。通过NDC和MCI进 行比较时的AUC为0.649，通过NDC和AD进行比较时的AUC为0.673。图3的A)是TTR的差异解析 图，通过NDC和AD进行比较时，AD中C3显著减少(t检定、P值5.81化-4)。图3的8)^及〇是通 过NDC和MCI、NDC和AD进行比较时的R0C曲线。通过NDC和MCI进行比较时的AUC为0.677，通过 NDC和AD进行比较时的AUC为0.730。
[0215]针对C3、ApoAl、TTR运3个标记物蛋白质，为了就相对于NDC，精度更良好地区分 MCI、AD的组合进行解析，进行了试验例2。
[0216] [表 1]
[0217]
[0220] [1]来自载脂蛋白A1的肤(ApoAlK序列号1)
[0221] 〔完整蛋白质/肤）
[0222] 0001 MKAAVLTI.AV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDR￥KDLAT VYVDVLKDSG 0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE Oi〇] KHTFGI.RQEM SKDLE巨VKAK VQPYLDBFQK KWQEEMELYR QKVEPL民八EL 0151 UEGAROKLHE LUEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAFY SDELRQRLAA 020! RLFALKHNGG ARLAFYHAKA TEHLSTLSFK AKPALFDLR〇 GLLPVLESFK 0251 V S F L S ALEE Y TKKLNTQ
[0223] [2]来自甲状腺素运载蛋白的肤(TTRK序列号2)
[0224] 〔完整蛋白质/肤）
[0225] 0001 MASH民LLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV 民GSPMNVAV 0051 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK YEIDTKSYWK 0101 AT.GTSPnir.TI AEVVFTANDS GPRRYTTAAL LSPySYSTTA VVTNPKE
[0226] [3]来自补体C3的肤(C3)(序列号3)
[0227] 〔完整蛋白质/肤）
[022引 0001 MGPTSGPSLL LLLLniLPLA LGSPMYSHT 脚正民 LCSEC TMVLRAHDAO 0051 GDVPVTVTVH DFPGKKXVLS S丘脚VLTPAT NHM娜VTFTI PANREFKSEK 0101 G民NKFV]VU\ TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL F巧ΤΟΚΠΥΤ PGSTVLYRIF 0151 TVNHKLLPVG RTVMVNTENP FX：iTPVK〇DSL SS〇NQLC.VLP LSWDIPELVN 肥01 MGQWKJRAYY ENSPQQVKT EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
[0229] 0251 LEVTITARFL YGICKVEOTAF V 圧烟 QDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV 0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLY GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AE 民SGIPIVT 0351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPm VQGnOTVQSL 0401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITV 民 TKKQE LSEAEQAT 民T MOAI.PYSTVG 0451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKTRYY TYLIMNKGRI. 0501 LKAGRUVREP GQDLVVXPLS ITTD 打 PSF 及 LVAYYTLIGA SGQREVVADS 0551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS [mQPVPGQQ MILKmCDUG ARVVLVAVDK ()601 GVrVLNKKNK LTQS"\W)VV E齡扣好CTPG SC;[y)YA(rW^ DAGLTFTSSS 0651 (乂)QTM;)RAnL QCPQPAARRR RSVQLTHKRM DKVGKYmTL KKCCEDGMRE 0701 NPiviRFSCQ 民民 TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELR 民 QHA 民 ASHLGLARSN 0751 LDEDIIAEEN IVSRSEFFES WLWNVEDLiCE PPKNGISTKX MNIFLKDSrr 0801 TWHLAVSMS DKKGICVADF FEVTVMQDFF IDL 民 LPYSVV 反NEQVEI 民 AV 085 I LYNY民QNQEL ICVRVELLHNP AFCSLATTK及氏HQQTVTIPP KSSLSVPYVT 0901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPF 0951 RLG 民 EGVUKE DIPPADLSL)。VPDTESETRl LLUGTi，VA(：)M TEDAVDAE民L 1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGL及
[0230] ICROGALELIIC 1051 KGYTUULAFR yPSSAFAAFV KRAPSTVVLTA YVVKV巧LAV NLIAmSOVL nui CGAViaV.ULE WKWWFQE DAPVIWEMl GULRNNNEKD MALTAFVLiS 1151 L〇EAI(DICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA lAGYALAQMG 1201 民LKGPLLNKF LTTAKDKN民W EDPGKULYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP 1251 f'VVRW说EQ及 YYUGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQiOMPD岛Q ELNLDVSLQL 1301 PS 民 SSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG π SVVTMYHA 1351 KAKDQLTCNIC FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEiCT 艮 Y 艮GDQDATM 1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK 1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT 民 FYHPEKEDG 1501 KLMCLCRDEL C及CAEENC巧 QKSDDKVTLE ERLDKLAC邸G VDYVYIO瓜 LV !55l KVQLSNDFDE YiMAiCQTHC SGSDEVQVGQ QRTFlSPiKC RE八LKLEEKK 1601 IIYLMWGLSSD rWGCKPNLSY IIGKDTWVE打 W阳