一种植物叶表皮毛脱除方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于植物分类领域，具体涉及一种植物叶表皮毛脱除方法。
【背景技术】
[0002] 叶表皮是叶片表面的一层初生保护组织，直接或间接影响植物和外界环境间的气 体和水分交换，快速响应外界环境变化，对植物光合作用、蒸腾作用和呼吸作用等生理生态 特征有着重要影响。同时由于叶片生存于植物的主要生活时期，一些特征明显受基因控制， 气孔类型、气孔上下表皮分布的多少以及与表皮细胞的形状、大小等特征是植物分类的重 要依据，是非生殖器官最广泛应用的，在分类学上具有重要的应用意义。
[0003] 植物界中有一部分植物叶表皮毛丰富，采用离析法，手撕表皮法均不能将它解析 分离开。在扫描电镜下也只能看清表皮毛的形态，无法看清表皮毛下方气孔类型、气孔大小 以及表皮细胞形态等特征。植物叶片气孔特征和表皮细胞特征在分类学上有着重要意义， 是植物光合作用、蒸腾作用和呼吸作用等生理生态过程的主要影响因素之一，但是目前尚 未有一种方法在不破坏表皮细胞的前提下有效脱除叶片表面密被的表皮毛。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种在不破坏表皮细胞的前提下有效脱除叶片表面密被的 表皮毛的植物叶表皮毛脱除方法。
[0005] 本发明的植物叶表皮毛脱除方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006] 将新鲜叶片放置于2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液中固定，然后取出叶片 用体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液浸泡48h，再置于50 °C的体积比1:1的二甲苯和丙酮混 合液中连续煮72h，每12h更换新的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液1次，然后取出叶片置 于体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用刀片刮掉下叶片的表皮毛和蜡被，刮的过程中， 叶片始终在体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，然后取出刮掉下表皮毛和蜡被的叶片置 于体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用超声波清洗4次，每次15min，每次清洗完后均更 换新的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液，最后用2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液固 定。
[0007] 所述的2.5 %戊二醛-2 %多聚甲醛混合固定液可配制总量200ml:
[0008] 100ml (0 · 2mol 磷酸缓冲液 PH7 · 2)+20ml (25 % 戊二醛 Glutaraldehyde)+25ml (16% 多聚甲醛Formaldehyde)+55ml(蒸馏水）。用量根据植物叶片大小来定，植物叶与固定液体 积比1:2。
[0009 ] 所述的2.5 %戊二醛-2 %多聚甲醛混合固定液固定都是在固定液中固定12h。
[0010]利用本发明的方法能够有效的脱除植物叶表皮毛，可以观察叶表皮形态结构，如 细胞、气孔类型大小，在分类学上具有重要意义。
【附图说明】：
[0011] 图1是桃金娘的未处理的叶下表皮扫描电镜照片，其叶下表皮有灰色茸毛，A和B是 不同的放大倍数下；
[0012] 图2是桃金娘按照本发明的植物叶表皮毛脱除方法处理的叶下表皮扫描电镜照 片，其中A、B和C是不同的放大倍数下；
[0013] 图3是白楸的未处理的叶下表皮扫描电镜照片，其嫩叶两面均密被黄褐色或灰白 色星状绒毛，老叶上表皮无毛，其中A和B是不同的放大倍数下；
[0014]图4是白楸按照本发明的植物叶表皮毛脱除方法处理的叶下表皮扫描电镜照片， 其中A、B和C是不同的放大倍数下；
[0015] 图5是窄叶半楓荷的未处理的叶下表皮扫描电镜照片，其叶下表皮密被黄褐色或 黄白色茸毛及星状毛两种，其中A和B是不同的放大倍数下；
[0016] 图6是窄叶半楓荷按照本发明的植物叶表皮毛脱除方法处理的叶下表皮扫描电镜 照片，其中A、B和C是不同的放大倍数下。
【具体实施方式】：
[0017] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018] 实施例1:
[0019] 配制总量100ml (h2mol磷酸缓冲液PH 7.2
[0020] A磷酸氢二钠(Na2HP〇4 · 12H20) 72ml
[0021] B磷酸二氢钠（NaH2P〇4 · 2H20) 28ml
[0022] 配制总量200ml 2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液
[0023]
[0024] 样品采集地广东省肇庆市鼎湖山国家自然保护区。
[0025] 选择桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(桃金娘科Myrtaceae桃金娘属 Rhodomyrtus)、白揪Mallotus paniculatus(大戟科Euphorbiaceae野桐属Mallotus)、窄叶 半楓荷Pterospermum lanceaefolium(梧桐科Sterculiaceae翅子树属Pterospermum)三种 植物叶片密被绒毛的植物作为试验材料。
[0026] 取新鲜叶片，切成lcm X 0.8cm长方形，放置装有2.5 %戊二醛-2 %多聚甲醛混合固 定液的离心管中固定12h，然后取出叶片用体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液浸泡48h，再置 于50 °C (恒温金属浴JS-400A加热）的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中连续煮72h，每12h 更换新的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液1次，然后取出叶片放到培养皿里，滴体积比1:1 的二甲苯和丙酮混合液，用单面刀片刮掉下表皮毛和蜡被，刮的过程中，一直不断滴体积比 1:1的二甲苯和丙酮混合液使叶片始终在体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，然后取出刮 掉下表皮毛和蜡被的叶片置于体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用超声波B R A N S 0 N 1510(50~60HZ 90W)清洗4次，每次15min，每次清洗完后均更换体积比1:1的二甲苯和丙酮 混合液，最后用2.5 %戊二醛-2 %多聚甲醛混合固定液固定12h。固定好的叶片在按照常规 的扫描电镜单固定常规方法进行制样，其包括缓冲液冲冼、丙酮系列脱水、叔丁醇过渡、冷 冻干燥、粘台、离子溅射仪镀铂金、扫描电子显微镜上机观察并拍照。
[0027] 对照组不经过处理，直接用2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液固定12h。固定 好的叶片在按照常规的扫描电镜单固定常规方法进行制样，其包括缓冲液冲冼、丙酮系列 脱水、叔丁醇过渡、冷冻干燥、粘台、离子溅射仪镀铂金、扫描电子显微镜上机观察并拍照。 [0028]桃金娘的处理结果如图1和图2所示，其中图1是桃金娘的未处理的叶下表皮扫描 电镜照片(对照），其叶下表皮有灰色茸毛，A和B是不同的放大倍数下；图2是桃金娘按照本 发明的植物叶表皮毛脱除方法处理的叶下表皮扫描电镜照片，其中A、B和C是不同的放大倍 数下。
[0029]白楸的处理结果如图3和图4所示，图3是白楸的未处理的叶下表皮扫描电镜照片 (对照），其嫩叶两面均密被黄褐色或灰白色星状绒毛，老叶上表皮无毛，A和B是不同的放大 倍数下；图4是白楸按照本发明的植物叶表皮毛脱除方法处理的叶下表皮扫描电镜照片，其 中A、B和C是不同的放大倍数下。
[0030] 窄叶半楓荷的处理结果如图5和图6所示，图5是窄叶半楓荷的未处理的叶下表皮 扫描电镜照片(对照），其叶下表皮密被黄褐色或黄白色茸毛及星状毛两种，其中A和B是不 同的放大倍数下；图6是窄叶半楓荷按照本发明的植物叶表皮毛脱除方法处理的叶下表皮 扫描电镜照片，其中A、B和C是不同的放大倍数下。
[0031] 从上述结果可以看出，利用本发明的植物叶表皮脱除方法可以有效脱除植物叶表 皮毛，可以观察叶表皮形态结构(细胞、气孔类型大小），在分类学上有着重要意义。
【主权项】
1. 一种植物叶表皮毛脱除方法，其特征在于，包括以下步骤： 将新鲜叶片放置于2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液中固定，然后取出叶片用体 积比1:1的二甲苯和丙酮混合液浸泡48h，再置于50°C的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液 中连续煮72h，每12h更换新的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液1次，然后取出叶片置于体 积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用刀片刮掉下叶片的表皮毛和蜡被，刮的过程中，叶片 始终在体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，然后取出刮掉下表皮毛和蜡被的叶片置于体 积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用超声波清洗4次，每次15min，每次清洗完后均更换新 的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液，最后用2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液固定。2. 根据权利要求1所述的植物叶表皮毛脱除方法，其特征在于，所述的2.5%戊二醛-2 %多聚甲醛混合固定液固定都是在固定液中固定12h。
【专利摘要】本发明公开了一种植物叶表皮毛脱除方法。将新鲜叶片放置于2.5％戊二醛-2％多聚甲醛混合固定液中固定，然后取出叶片用体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液浸泡48h，再置于50℃的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中连续煮72h，每12h更换新的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液1次，然后取出叶片置于体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用刀片刮掉下叶片的表皮毛和蜡被，刮的过程中，叶片始终在体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，然后取出刮掉下表皮毛和蜡被的叶片置于体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液中，用超声波清洗4次，每次15min，每次清洗完后均更换新的体积比1:1的二甲苯和丙酮混合液，最后固定液固定。
【IPC分类】G01N1/28
【公开号】CN105651573
【申请号】
【发明人】胡晓颖, 易慧琳, 邓汝芳, 任海, 徐信兰
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月5日