一次性鉴别绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭肉的方法
【技术领域】
[0001]本项发明技术将分子生物学技术应用于食品检测领域，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过多重PCR反应和核酸电泳技术检测绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和家鸭的肉样品。
【背景技术】
[0002]线粒体DNA(Mitochondrial DNA)是动物体内唯一存在的核外遗传信息载体，为双链的闭合环状分子，为严格的母系遗传，在高等动物中结构基本一致，大小为16 kb左右，有37个基因(细胞色素C氧化酶的三个亚基CO 1、⑶I1、C0 III的基因，细胞色素b的基因，两个编码ATP合成酶亚基ATPase6和ATPase8的基因，NADH脱氢酶的7个亚基的基因以及2个rRNA基因和22个tRNA基因)，另外还有一段和复制转录有关的控制区D-loop。
[0003]线粒体DNA进化速度较快，具有很强的种属特异性，并且具有分子量小、结构简单稳定、不与组蛋白结合、存在广泛、拷贝数极多、易于操作和分析等优点。线粒体DNA最早用于动物检材的种属鉴定是在法医和考古领域，近年来也被试图用于动物源食品、饲料检测，特别是当检材为熟制品或成分复杂的混合物时，蛋白质分析技术和免疫方法显得无能为力，线粒体DNA的PCR检测则显示出优越性，即使经过高压、蒸煮等处理也会有少量线粒体DNA完整保存下来，经PCR反应扩增百万倍后可经电泳显带，或用更灵敏的实时荧光PCR检测出来。
[0004]目前用于种属鉴定的分子生物学方法主要有:随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、扩增片段长度多态性分析(AFLP)、种属特异PCR技术等。
[0005]PCR-RFLP技术结果准确，操作简单，同时对试验设备要求较低，冯强等采用PCR-RFLP技术对Cyt B基因在人及动物间差异进行了研究，结果表明，在15种常见动物中，狗线粒体DNA有微弱的非特异性扩增产物；对鸡、蛙、鸭、鱼、马线粒体DNA无扩增产物。根据扩增产物的有或无，可初步区分人与狗、鸡、蛙、鸭、鱼、马。扩增产物经Alu I酶切后，除鳝鱼及人的扩增产物不被酶切外，牛、猪、羊、猫、猴、兔、豚鼠和鼠均有不同变化。Zehner等采用相同的引物扩增不同动物线粒体DNA后，联合应用内切酶Alu I和Nco I酶切扩增产物，人类cyt b基因的981bp片段被Alu I酶切，产生978bp和3bp片段，除鸡和火鸡外，其他动物cyt b基因酶切片段与人类cyt b基因酶切片段明显不同。NcoI可以酶切鸡和火鸡cyt b基因而不酶切人类cyt b基因。
[0006]种属特异PCR是根据扩增的目的基因设计高特异性引物，包括单一或多种属特异性引物，相应的扩增产物就有单一和多种种属目的片段。常规PCR技术一次只能扩增一个目的片段。在肉制品检测中，混合肉的成分比较复杂，必须对成分的不同动物源性同时进行检测。若是用单一 PCR分开检测这几个项目，就存在操作繁琐，耗时费事和试剂消耗大等缺点。Matsunaga等建立多重PCR技术，通过7种按适当比例混合的引物，用一次PCR同时对食品中的6种肉——牛肉、猪肉、鸡肉、山羊、绵羊和马肉中限制性DNA片段进行检测，其中7种引物包括一条用线粒体色素细胞b基因设计的正链弓I物和6条各物种的特异性的DNA引物，反应采用35个循环进行PCR扩增，从山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马肉的扩增产物中分离出长度分别为157，227，274，331，398和439bp的DNA片段，从而根据DNA片段的长度来鉴别混合肉制品的动物源性。张娟等克隆出了鸭线粒体DNA CO III基因(Genbank access1n:DQ655706)，利用BLAST软件、B1edit软件分析线粒体DNA序列，根据鸭线粒体DNA CO III基因的特异性，设计引物(5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3, )、(5' -TACCAACCCCCGAACTA GGC-3')，利用此引物 PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226bp。王丽媛等根据线粒体细胞色素b基因设计一条共用的上游引物，根据种属差异设计其下游引物，然后通过多种类引物的合理配比，可以同时对样品中的多种动物源成分进行鉴定。
[0007]针对市场上用鸭肉、海狸鼠肉和水貂肉经过加工冒充羊肉的现象，需要一个统一的检测方法，以鉴别绵羊肉、山羊肉、鸭肉、水貂肉和海狸鼠肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。曾经提出或使用过的方法，如红外线光谱检测、蛋白质指纹方法、免疫学方法、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)和扩增片段长度多态性分析(AFLP)等均存在某些缺点，如检测结果不稳定、难以区分混合肉样、难以鉴别熟肉制品等。本发明利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过PCR反应得到长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物电泳检测，能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、鸭肉、水貂肉和海狸鼠肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。
【发明内容】
[0008]本发明既提供一种由10 种引物(S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R 的浓度为 1.47,1.47,0.88,0.88,0.88,0.88,1.18,1.18,0.59,0.59 μ mol/L μ mol/L)、PCR 反应液、DNA Marker、五种目的片段组成的试剂盒，也提供一种用这种试剂盒对待测样品DNA进行扩增并电泳检测的方法。
[0009]为了鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列针对每种动物分别设计各自的种属特异性引物，分别以绵羊、山羊、鸭、水貂和海狸鼠5种动物的全基因组DNA为模板，通过PCR反应得到5种长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，5种长度不同的条带可以在电泳图中分辨出来(见附图1)。
[0010]用于鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉所用的5种动物引物序列为:
绵羊:
S-F: 5’-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3’
S-R: 5’-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3’ 扩增片段大小为 265bp 山羊:
G-F: 5’-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3’
G-R: 5’-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3’ 扩增片段大小为 578bp 水貂:
M-F: 5’- CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3’ M-R: 5’- TGCAGTAGGGGAATGATAG-3’ 扩增片段大小为 230bp
海狸鼠:
N-F: 5’- CGGCTCTTACACCTTCATA-3’
N-R: 5’- TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3’ 扩增片段大小为 812bp 鸭:
D-F: 5’- GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3’
D-R: 5’- GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3’ 扩增片段大小为 348bp本发明所针对的绵羊属于哺乳纲-偶蹄目-反刍动物亚目-牛科-羊属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_001941.1 ;山羊属于哺乳纲-偶蹄目-反刍动物亚目-牛科-羊属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_005044.2 ;水貂属于哺乳纲-食肉目-鼬科-鼬属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_020641.1 ;海狸鼠属于哺乳纲_啮齿目_彖猪型亚目_海涯鼠科_海涯鼠属，线粒体DNA序列来自于Genbank,序列号为AF422919.1 ;家鸭属于鸟纲_雁形目_鸭