玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及玉米ZmGFTI基因在提高 植物叶酸含量中的应用。
【背景技术】
[0002] 叶酸属于水溶性的B族维生素，是四氢叶酸及其衍生物的统称。由于氧化状态不同 而存在不同形式的叶酸衍生物，如四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5，10-亚甲 基四氢叶酸等。在大多数物种中，叶酸在一碳转移反应中作为供体或受体发挥重要作用。叶 酸参与嘌呤、甲酰甲硫氨酸-tRNA、胸苷酸、甘氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸的生物合成，并且叶 酸还参与泛酸盐的合成、甲基化反应和组氨酸代谢。在植物中，叶酸还与木质素、生物碱、甜 菜素和叶绿素的生物合成相关，对植物的光呼吸也是必须的。人类和其他动物不能自身合 成叶酸，只能从饮食中摄取所需的叶酸，植物是人类获取叶酸的主要来源。叶酸参与这些重 要的生命过程，因此叶酸摄入不足会许多造成严重的健康问题，例如巨幼红细胞贫血、神经 管缺陷等，还有导致癌症的潜在风险。所以叶酸缺乏成为一个全球性的健康问题。尽管在有 些国家和地区实行了食物强化和维生素片补充等有效的措施来改善叶酸缺乏的状况，但是 对于不发达国家和地区来说还是很难实现的。
[0003] 5-甲酰四氢叶酸，又称做亚叶酸，是最稳定的自然形式的叶酸，作为一种稳定的储 存形式是玉米籽粒中最丰富的叶酸组分。其通过丝氨酸羟甲基转移酶的副反应生成，可以 抑制丝氨酸羟甲基转移酶和其它大部分叶酸依赖酶的活性。5-甲酰四氢叶酸是唯一一个不 参与一碳代谢的叶酸形式，其在代谢活跃组织中发挥的具体作用目前还不清楚。叶酸遇光、 遇热就不稳定，容易降解失去活性，所以人体真正能从食物中获得的叶酸并不多。提高叶酸 中稳定形式叶酸所占的比例，增加叶酸的生物可利用率，也是叶酸强化的一种重要途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供玉米ZmGFTI基因在提高植物叶酸含量中的应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明通过对玉米自然变异群体513份自交系材料中5-甲 酰四氢叶酸含量进行测定，结合RNA-Seq数据中挖掘到的基因型数据，并且评估自然变异群 体群体结构和亲缘关系的影响，利用全基因组关联分析的方法定位到一个位于玉米第5号 染色体上显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的基因 GFT1，其编码谷氨酸亚胺甲基转移酶1。该基 因所在位点的编号为GRMZM2G124863(参考玉米基因组B72RefGen_v2)。
[0006] 玉米自交系Qi319中GRMZM2G124863基因的CDS全长为993bp，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，GRMZM2G124863基因编码330个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 2所示。经过NCBI比对， 该蛋白的21-228位氨基酸为亚胺甲基转移酶环化脱氨酶结构域的N端亚结构域。与玉米中 的其他两个GFT基因 GRMZM2G349536和GRMZM2G083711编码蛋白的序列同源性较低，分别为 40.0%和 39.8%。
[0007] 而在玉米自交系B73中，多态性位点Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5.s_19676907
[A/G]的等位变异，共同造成该蛋白底物结合活性位置的氨基酸变异（由天冬酰胺变为甘氨 酸），从而影响5-甲酰四氢叶酸的含量。玉米自交系B73ZmGFTl基因的⑶S全长为981bp，核苷 酸序列如SEQIDN0 :9所示，ZmGFTl基因编码326个氨基酸，序列如SEQIDN0:10所示。
[0008]本发明提供玉米ZmGFTl基因在提高植物叶酸含量中的应用。
[0009] 所述玉米ZmGFTl基因的⑶S序列如下：
[0010] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或
[0011] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0012] iii)在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0013] iv)与i)、ii)或m)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0014] 本发明还提供携带有玉米ZmGFTl基因的载体、宿主细胞、转基因细胞系及工程菌。 [0015]携带有玉米ZmGFTl基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0016] 前述的应用，采用农杆菌介导的方法，将携带有玉米ZmGFTl基因的表达载体转入 植物组织中，筛选转基因植株。所述表达载体包括植物双元表达载体，优选PCAMBIA3301、 pH2GW7〇
[0017] 本发明所述植物包括但不限于玉米、拟南芥。
[0018]本发明又对另一个自然变异群体的155份玉米材料的GFT1基因进行重测序，挖掘 出更多的等位变异，利用候选基因关联分析的方法，发现了 7个显著影响5-甲酰四氢叶酸含 量的多态性位点。7个多态性位点中，4个插入缺失位点位于5'非翻译区，3个SNPs位于基因 编码区。其中位于该基因编码区的多态性位点Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5. s_ 19676907 [A/G]等位变异，共同造成了该蛋白底物结合活性位置的氨基酸变异（由天冬酰胺 变为甘氨酸），显著影响了 5-甲酰四氢叶酸含量，可以解释5-甲酰四氢叶酸变异的28%。
[0019] 本发明还提供与玉米叶酸含量相关的SNP标记，所述SNP标记位于玉米自交系B73 第5号染色体Chr5. s_19676906和Chr5. s_19676907位点（即玉米自交系B73ZmGFTl基因如 SEQ ID NO:9所示序列的第682位和第683位碱基），两个位点处的碱基均为G的玉米叶酸含 量显著高于两个位点处的碱基均为A的玉米叶酸含量。
[0020] 上述SNP标记位于玉米自交系Qi319ZmGFTl基因如SEQ ID N0:1所示序列的第694 位和第695位碱基，两个碱基均为G的玉米叶酸含量显著高于两个碱基均为A的玉米叶酸含 量。
[0021] 本发明还提供用于检测所述与玉米叶酸含量相关的SNP标记的引物，包括正向引 物F 5 ' -ATGGAGCCTCATCACGCAAAC-3 ' 和反向引物R 5 ' -TCAGTCGTCAGCGCAAGC-3 '。
[0022] 本发明还提供含有所述引物F和R的用于检测玉米叶酸含量的试剂盒。
[0023]本发明还提供利用所述与玉米叶酸含量相关的SNP标记或所述引物或所述试剂盒 鉴定玉米叶酸含量的方法。
[0024]所述方法包括以下步骤：
[0025] 1)提取待测玉米的基因组DNA;
[0026] 2)以待测玉米的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行PCR扩增反应；
[0027] 3)检测PCR扩增产物。扩增产物第694位和第695位碱基，两个碱基均为G的玉米叶 酸含量显著高于两个碱基均为A的玉米叶酸含量。
[0028]本发明进一步提供与玉米叶酸含量相关的SNP标记在玉米分子标记辅助育种中的 应用。
[0029]本发明利用全基因组关联分析的方法，首次在玉米中发现了 5-甲酰四氢叶酸代谢 的关键基因 ZmGFTl，并且发现了该基因中显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的关键SNP位点。这 不仅为在玉米和其他作物中研究叶酸代谢提供了理论基础，还可以通过基因工程手段，提 高转基因植物的叶酸含量，缓解人类在叶酸营养方面的隐形饥饿问题。
【附图说明】
[0030]图1为本发明实施例1中玉米ZmGFTl基因的PCR扩增结果;A为来源于玉米自交系 B73和Qi319的ZmGFTl基因扩增，用于转化拟南芥来研究自然变异对于5-甲酰四氢叶酸含量 的影响;B为来源于自交系Qi319的ZmGFTl基因的扩增用于转化玉米来研究ZmGFTl的功能。 [0031]图2为本发明实施例2中ZmGFTl基因在玉米中的相对表达量;从左到右依次为根、 茎、茎尖、嫩叶、花丝、果穗和授粉后10、15、20、25天的胚^!11)和胚乳化11)。
[0032]图3为本发明实施例3中对转ZmGFTl基因植株材料的PCR鉴定结果;A分别为转化了 自交系B73和Qi319ZmGFTl基因的转基因拟南芥植株，其中B1、B2、B6、B7、B18、B32SR B73GFT1CDS阳性拟南芥转基因植株，〇1、〇2、〇3、〇4为转如3196?11003阳性拟南芥转基因植 株;B为转化了 Qi319ZmGFTl的转基因玉米材料，其中26、128、147、177、347、372为阳性转基 因玉米植株。
[0033]图4为本发明实施例3中RT-PCR检测转基因拟南芥和转基因玉米中ZmGFTl的表达 量;A为阳性转基因拟南芥ZmGFTl转录水平检测，81、8236、87、818、832代表拟南芥转入来 自于自交系B73的ZmGFTl，Ql、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6代表拟南芥转入来自于自交系Qi319的 ZmGFTl ;B中13-128、13-147、13-177、13-372为阳性转基因玉米中ZmGFTl转录水平检测结 果。
[0034]图5为本发明实施例3中转基因拟南芥种子和转基因玉米叶片中5-甲酰四氢叶酸 含量的检测结果;A中灰色柱子代表转入来自于B73的ZmGFTl转基因拟南芥种子中叶酸水 平，黑色柱子代表转入来自于Qi319的转基因拟南芥种子中叶酸水平，白色柱子代表col野 生型拟南芥种子中的叶酸水平。B中白