一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，属于分子生物 学技术领域。
【背景技术】
[0002] 基因组DNA提取是开展分子生物学研究的一项重要技术环节，并被广泛地应用于 种质资源评价及育种研究，为便于查找动物的血缘关系和管理记录，在动物出生后往往采 用剪耳缺法对每个个体进行编号，此时采集耳缺组织可满足大样本量的研究且不伤害的动 物健康。目前从哺乳动物组织中提取基因组DNA的方法通常采用传统的酚-氯仿抽提法和试 剂盒法，前者在组织破碎后直接进行蛋白酶K消化处理，耗时长（2 12h)，细胞破碎不充分； 后者价格昂贵，且由于耳组织含有少量被毛，难消化，DNA提取浓度低，因此均不适用于大样 本量研究的提取。面对大量的研究个体和样本，快速、高效的耳组织基因组DNA提取方法将 有利于提尚研究效率。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是针对现有基因组DNA提取方法存在的DNA提取浓度 低或耗时长等缺陷，提供一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法。
[0004] 本发明采用以下技术方案： 一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，该方法的具体步骤如下： 1) 组织破碎:取组织样于灭菌离心管中，剪碎;快速加入预冷的TE裂解液，尽可能使细 胞充分破碎制成溶浆并对溶浆中DNA进行保护； 2) 组织裂解液消化； 3) Tris饱和酚抽提； 4) Tr is饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提； 5) 氯仿异戊醇抽提； 6) 醋酸钠和-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA; 7) 乙醇漂洗； 8 )TE缓冲液溶解DNA、保存。
[0005] 步骤1)中所述TE裂解液的组成为:pH8.0的10mM Tris-HCl和pH8.0的2mM EDTA。
[0006] 本发明的优点在于:在组织剪碎后快速加入预冷的TE裂解液，通过其成分中稍高 的EDTA组分浓度抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用，显著提高了DNA的得率(DNA浓度112~ 851 ng/yL，TE成分中ImM EDTA组份浓度时提取的DNA浓度40~160 ng/VL)，并结合预冷的 缓冲体系保护了DNA的完整性;Tris-饱和酚反复抽提有效去除蛋白质，节省了在消化过程 中加蛋白酶K消化蛋白质的时间（2 12h)，本发明提取DNA过程耗时约3h。
【附图说明】
[0007] 图1为本发明提取的哺乳动物耳组织基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图； 图2为现有技术的TE缓冲液成分中ImM EDTA (pH8.0)组份浓度时提取的哺乳动物耳组 织基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图； 电泳条件：1 yL DNA提取样品与1.0 yL 6 X Buffer上样缓冲液混匀，加样于1.0%的 琼脂糖凝胶，100 V电压，电泳30 min。
[0008] 图1中的基因组DNA条带清晰明亮，没有降解，即该方法提取的DNA完整性好、质量 高。图2中的基因组DNA明显不如图1的清晰明亮，有轻微的拖带现象，说明有DNA降解。
【具体实施方式】
[0009] 下面对本发明及其效果作进一步说明。
[0010] 一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，该方法的具体步骤如下： 1) 组织样在灭菌离心管中剪碎后快速加入预冷的TE，使细胞充分破碎并对溶浆中DNA 进行保护； 2) 组织裂解液消化省去了加蛋白酶K消化过夜的操作； 3) Tris-饱和酚抽提； 4) Tr is-饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提； 5) 氯仿异戊醇抽提； 6 )醋酸钠 (NaAc )和-20 °C预冷的无水乙醇沉淀DNA; 7) 乙醇漂洗； 8) TE溶解DNA、保存。
[0011]
【具体实施方式】如下： 1)TE裂解液配制（pH 8.0):1M Tris-HCl (pH8.0) 5 mL，0.5M EDTA (pH8.0) 2 mL， 加 ddH2〇定容至500 mL，高压灭菌。
[0012] 2)组织裂解液配制：1M Tris. HC1 (pH 8.0)25 mL，0.5M EDTA 100 mL，2M NaCl 25 mL，10% SDS 50 mL，加 ddH20定容至500 mL，高压灭菌。
[0013] 3)取约30 mg仔猪耳组织样，装入1.5 mL灭菌离心管，用手术剪刀剪碎(剪完每一 样品所用的镊子和手术剪刀都要用酒精棉球擦洗，以除去残留的组织样;并等待至酒精完 全挥发）； 4) 加入300 yL充分预冷至-20°C的TE裂解液，反复颠倒离心管5 min，3000 rmp离心5 min、弃上清液； 5) 加入600 yL组织裂解液，缓慢颠倒混匀10 min; 6) 加入600 yL Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀10 min，12000 rpm离心10 min，吸取上层清 液； 7) 重复步骤4)操作； 8) 加入300 yL Tris饱和酚和300 yL氯仿/异戊醇（24:1体积比），缓慢颠倒混匀10 min，12000 rmp离心10 min，吸取上清夜； 9) 加入600 yL氯仿/异戊醇(24:1)，混勾10 min，12000 rpm离心10 min，吸取上清夜； 10) 加入60 yL 3 M NaAc和在-20 °C充分预冷的无水冰乙醇1 mL，轻微摇晃至出现 乳白色丝状DNA沉淀，冰浴15 min，12000 rmp离心10 min，弃上清液； 11) 加入1 mL 75%乙醇漂洗，12000 rpm离心2 min，弃上清液； 12) 小心倒掉乙醇，将离心管倒扣与滤纸上，置于无菌操作台，至乙醇挥发完全； 13) 加入200 yL TE缓冲液，4 °C放置24 h使DNA完全溶解，琼脂糖凝胶电泳和紫外分 光光度计检测后-20 °C保存。
[0014] 步骤1)中所述TE裂解液的组成为10mM Tris-HCl (PH8.0)和2mM乙二胺四乙酸 (EDTA，pH8 · 0)。Tris的作用是缓冲体系的pH，而EDTA可以螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱 氧核酸酶对DNA的降解作用，为了保证裂解体系的pH并抑制核酸酶，该TE裂解液在EDTA组份 浓度上稍高于溶解DNA的TE缓冲液浓度，该对比效果见表1、2。
[0015] 表1为本发明提取的哺乳动物耳组织基因组DNA浓度和纯度经ND-1000型紫外分 光光度仪检测结果； 表1
表2为现有技术的TE缓冲液成分中ImM EDTA (pH8.0)组份浓度时提取的哺乳动物耳组 织基因组DNA浓度和纯度经ND-1000型紫外分光光度仪检测结果； 表2
基因组DNA的质量浓度以及在波长260 nm和280 nm处吸收值的比值(OD260/280)分别反 应基因组DNA的浓度和纯度。质量较好的DNA其0D26Q/28(x)值在1.7~1.9之间，比值大于1.9表 示DNA溶液中有RNA存在，由于RNA易降解，对动物遗传资源评价及育种的研究不会产生影 响。表1中提取出的基因组DNA质量浓度明显高于表2的方法中提取的基因组DNA浓度，说明 本发明方法提取的基因组DNA得率高。
[0016] 步骤1)中所述TE裂解液应在-20°c预冷至少30 min，对溶浆中DNA实施低温保护。 [0017]步骤1)中所述TE裂解液体积为300 yL，以确保彻底裂解样品，同时使裂解体系中 核酸浓度适中。由于核酸浓度低导致沉淀效率低，影响DNA得率;浓度过高，会使去除杂质的 过程复杂且不彻底，导致DNA纯度下降。
[0018] 步骤2)中所述的组织裂解液组成为1M Tris-HCl (PH8.0) 25 mL、0.5M EDTA 100 mL、2M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mL、ddH20 300 mL。
[0019] 步骤3)中所述的Tris-饱和酚抽提操作进行了2次。酚是很强的蛋白质变性剂， Tris-饱和酚反复抽提，能使变性的蛋白质溶解在其中，达到有效去除蛋白质的目的，节省 了消化过程中加蛋白酶K消化蛋白质的时间（2 12h)。
[0020] 步骤7)中所述乙醇浓度为75%，以很好的洗去加入的盐，避免了乙醇浓度太高达不 到脱盐效果和浓度太低使DNA溶解对提取效果的影响。
【主权项】
1. 一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征在于:该方法的具体步 骤如下： 1) 组织破碎:取组织样于灭菌离心管中，剪碎;快速加入预冷的TE裂解液，尽可能使细 胞充分破碎制成溶浆并对溶浆中DNA进行保护； 2) 组织裂解液消化； 3 )Tr is饱和酚抽提； 4. Tris饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提； 5) 氯仿异戊醇抽提； 6) 醋酸钠和-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA; 7) 乙醇漂洗； 8. TE缓冲液溶解DNA、保存。2. 根据权利要求1所述的一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征 在于:步骤1)中所述TE裂解液的组成为:pH8.0的10mM Tris-HCl和pH8.0的2mM EDTA。3. 根据权利要求2所述的一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征 在于:所述TE裂解液的体积为300yL。4. 根据权利要求2所述的一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征 在于:所述TE裂解液应在-20°C预冷至少30 min。5. 根据权利要求1所述的一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征 在于：步骤2)中所述的组织裂解液组成为：pH8.0的1M Tris-HCl 25 mL、0.5M EDTA 100 mL、2M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mL、ddH20 300 mL。6. 根据权利要求1所述的一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征 在于:步骤3)中所述的Tris-饱和酚抽提2次。7. 根据权利要求1所述的一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征 在于：步骤7)中所述乙醇浓度为75%。
【专利摘要】本发明公开了一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法包括：1）组织破碎和DNA保护；2）组织裂解液消化；3）Tris-饱和酚抽提；4）Tris-饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提；5）氯仿异戊醇抽提；6）NaAc和充分预冷（-20℃）的无水乙醇沉淀DNA；7）乙醇漂洗；8）TE缓冲液溶解DNA、保存。本发明显著提高了DNA的得率（DNA浓度112~851ng/μL），同时节省了DNA提取时在破碎细胞后加蛋白酶K进行消化过夜（≥12h）的时间，从组织破碎到基因组DNA提取完成总耗时约3h。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105647911
【申请号】
【发明人】滚双宝, 马艳萍, 杨巧丽
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月8日