一种基于罗丹明b的gsh传感器、制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种基于罗丹明B的GSH荧光传感器、制备及 应用。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽(GSH)广泛在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。GSH在人体内的 生化防御体系起着重要作用，具有多方面的生理功能。它的主要生理作用是能够清除掉人 体内的自由基，作为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基。此外 GSH还具有解毒、保护肝脏、抗辐射、增强免疫力、抗过敏等功能。人体内缺乏GSH会引起许多 健康问题，例如:皮肤损伤、毛发色素脱失、肝损伤等。鉴于GSH对人体如此至关重要，研究一 种能够快速方便检测GSH的方法具有十分重要的意义。
[0003] 目前，检测GSH的方法主要有:分光光度法、焚光法、高效液相色谱(HPLC)法、高效 毛细管电泳法(HPCE)、流式细胞仪法等，然而这些方法存在很多缺点，如所需仪器价格较为 昂贵费，携带不便，敏感性差，所测定的GSH浓度范围不大，对于含GSH量较小的细胞中测量 则更是困难等。与此相反，由于化学发光不需要任何光源，因而在对荧光探针进行化学发光 成像检测时，不存在荧光检测或者荧光成像时不可避免的光学背景的干扰，从而可以获得 更低的检出限。
[0004] 罗丹明类染料由于其摩尔吸光系数较大，荧光量子产率高、光谱性能优越、结构简 单、易于修饰、吸收波长范围广等优势，已经被广泛应用与分子探针设计，目前，罗丹明类分 子探针多用于检测Al 3+，Cr3+，GSH等。
[0005] 文献l(Liu X，Zhang W, Li C, et al · Nanomolar detection of Hey，GSH and Cys in aqueous solution, test paper and living cells[J]. Rsc Advances, 2014, 7 :4941-4946.)报道了一种利用萘酰亚胺类衍生物和磺酰氯进行缩合，合成出一种 新型的GSH传感器的方法，产率54.8%。
[0006] 文南犬2(Kim G J，Lee K, Kwon H, et al. Ratiometric Fluorescence Imaging of Cellular Glutathione[J] · Organic Letters, 2011，13(11) :2799-2801 ·)报道了一 种利用香豆素衍生物和苯酚衍生物进行缩合，合成出一种新型的GSH传感器的方法，产率 60% 〇
[0007] (1)如文献1中，选择性不是特别好，对Hey、Cyst也有响应，而且效果和GSH相当，而 且产率不高。
[0008] (2)如文献2中，缓冲溶液浓度过低，只有0.1 mM。很难保在中性条件下进行测试。
[0009] 上述缺陷造成至今为止，应用现有工艺方法难以得到合成简单，产率高而且选择 性较好的GSH传感器制备方法。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种基于罗丹明B的GSH荧光传感器、制备及应用。
[0011] 实现本发明目的的技术解决方案是： 一种基于罗丹明B的GSH焚光传感器，该焚光传感器的结构如下：
[0012] 上述结构的基于罗丹明B的GSH焚光传感器的制备方法，包括以下步骤:室温下，将 化合物2、化合物4、催化剂三乙胺在有机溶剂中反应，反应完成之后，减压除去溶剂，萃取， 硅胶柱分离，得到淡黄色粉末即为目标化合物GSH荧光传感器，其中，化合物2和化合物4的 结构如下：
本发明中，化合物2、化合物5、催化剂三乙胺的摩尔比为1.2:1:2 本发明中，反应时间2_3h。
[0013] 本发明中，有机溶剂选自乙醇，甲醇，乙腈，二氯甲烷中的任一种。
[0014] 本发明中，硅胶柱分离中的洗脱液采用MeOH:CH2Cl2=l :99的混合液。
[0015] 本发明中，所述的基于罗丹明B的GSH荧光传感器用于检测生物体的谷胱甘肽。
[0016] 本发明与现有技术相比，其显著优点是：（1)本发明以罗丹明为主体合成了一种新 型GSH荧光传感器，具有良好的光稳定性，长波长发射以及量子产率高等优点。（2)本发明所 选用原料成本低，合成步骤简单，后处理亦很方便，较易实现大规模生产。（3)本发明采用酰 氯与伯胺缩合反应方式，合成方法简单，反应条件温和，且产率较高。（4)本发明所涉及传感 器能选择性检测GSH，且敏感度较高，在检测细胞内的GSH方面具有很大的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的化合物2咕NMR。
[0018] 图2为本发明的化合物2 13C NMR。
[0019] 图3为本发明的化合物3咕NMR。
[0020] 图4为本发明的化合物3 13C NMR。
[0021] 图5为本发明的化合物5咕NMR。
[0022] 图6为本发明的化合物513C NMR。
[0023] 图7为本发明的化合物5的荧光选择性测试图。
[0024]图8为本发明的化合物5的时间稳定性测试图。
【具体实施方式】
[0025](一)传感器化合物的合成 本发明提供了目标产物在GSH检测中的应用，发现其对GSH有很好的检测效果。本发明 合成路线如下：
[0026](二)荧光性能测试 将65!1、078、!1(^、1^8、5虹、6111，617等不同氨基酸加入化合物5的溶液中，进行荧光响应 测试。
[0027]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0028]本发明一种基于罗丹明B的GSH荧光传感器的制备方法，包括以下步骤： 第一步，将罗丹明B与过量的乙二胺在无水乙醇中回流12h以上，反应完成后，减压除去 溶剂，萃取，硅胶柱分离，最后得到淡黄色粉末，也即化合物2， 化合物2的结构如下：
第二步，将3,5_二氨基苯甲酸与马来酸酐在氯仿中回流20h，反应完成后，过滤除去溶 剂，烘干滤饼，得到黄绿色粉末，再与无水醋酸钠在乙酸酐中反应2h，温度为100°C，反应完 成后，将反应液倒入冰水中，继续搅拌lh，然后过滤除去溶剂，并用水冲洗滤饼10次，最后得 到苍白色固体粉末，也即化合物3， 化合物3的结构如下： COOH
第三步，将第二步中得到的化合物3在二氯亚砜中回流过夜，反应完成后，减压除去溶 剂，得到白色粉末，也即化合物4， 化合物4的结构如下：
第四步，室温下，将第一步中得到的化合物2,第四步中得到的化合物5,三乙胺在二氯 甲烷中反应，反应完成之后，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离，得到淡黄色粉末即为所述 GSH荧光传感器。
[0029]实施例1荧光化学传感器的合成 1.化合物2的合成 将罗丹明B(960 mg，2 mmol)与乙二胺（1.3 ml，20 mmol)在无水乙醇(40 ml)中，控制 反应温度在80 °C，反应时间为12 h，反应完成之后，减压除去溶剂，萃取，经硅胶柱分离得 到淡黄色固体(880 mg，92%)。化合物2? NMR，13C NMR分别如图1，图2所示。
[0030] 2.化合物3的合成 将3,5-二氨基苯甲酸（200mg，1 · 31mmol)与马来酸酐(385mg，3 · 93mmol)在氯仿中回流 反应20h。反应结束后，过滤除去溶剂，固体烘干后，得到黄绿色固体，与无水乙酸钠 (35. lmg，0.43mmol)在乙酸酐中反应2h，温度100°C。反应后，将混合液加入到冰水中，继续 搅拌lh。之后，抽滤除去液体，用水反复冲洗滤饼，烘干，得到苍白色固体（170mg，42%)。化合 物3咕NMR， 13C NMR如图3,图4所示。
[0031] 3.化合物5的合成 将化合物3(50mg，0.16mmo 1)在二氯亚砜中回流反应12h，减压除去溶剂，得到白色固 体4(49mg，93%)。
[0032] 4.化合物6的合成 将化合物4(45mg，0.14mmol)与化合物2(87.60mg，0.18mmol)在二氯甲烧中反应，加入 48ul三乙胺(0.27mmol)，室温反应2.5h。反应完成之后，减压除去溶剂，萃取，经硅胶柱分离 得到淡黄色固体(55mg，52%)。化合物5? NMR，13C NMR分别如图5,图6所示。
[0033]实施例2荧光选择性能测试 GSH荧光传感器5在乙醇中具有很好的溶解性，经验证，化合物5可以溶解在EtOH: HEPES (0.6 mM，pH=7.2)=3:2混合液中，配制500 ml该溶液作为储备液(pH=7.2)。
[0034] 精确配置63!1荧光传感器5为1\10-3111〇1/1^切!1-!1 20混合液(3/2，￥八），氨基酸 GSH、Cys、Hcy、Lys、Ser、Gln，Gly等浓度为5X10-3mol/L水溶液，以及用Et0H :HEPES(0·6 mM，pH=7.2,3/2, V/V)溶液。
[0035] 荧光选择性实验如图6所示，取3ml储备液置于液体池中，加入120uLGSH到荧光传 感器5溶液，测其初始荧光强度值，然后分别加入配置好的各种氨基酸溶液120uL，测量其稳 定时的荧光强度。观察图7可知，化合物5对GSH有明显响应效果，并且在588 nm处荧光强度 达到最大值，也即化合物5对GSH有很好的选择性。
[0036] 实施例3时间稳定性 荧光传感器5在乙醇中具有很好的溶解性，经验证，化合物5可以溶解在MeOH: HEPES (0.6 mM，pH=7.2)=3:2混合液中，配制500 ml该溶液作为储备液(pH=7.2)。
[0037] 精确配置63!1荧光传感器5为1\10-3111〇1/1^切!1-!1 20混合液(3/2，￥八），氨基酸 GSH浓度为5X10-3 mol/L水溶液，以及用Et0H:HEPES(0.6 mM, pH=7.2,3/2, V/V)溶液。
[0038] 时间稳定性实验如图所示，取3ml储备液置于液体池中，加入120 uLGSH到荧光传 感器5溶液，测其初始荧光强度值，然后每隔几分钟测量其荧光强度，直到稳定为止。观察图 8可知，化合物5对GSH在大约在50 min达到稳定。
【主权项】
1. 一种巧光传感器，其特征在于，该巧光传感器的化学结构如下：2. -种如权利要求1所述的巧光传感器的制备方法，其特征在于，包括W下步骤:室溫 下，将化合物2、化合物4、催化剂=乙胺在有机溶剂中反应，反应完成之后，减压除去溶剂， 萃取，硅胶柱分离，即得目标传感器，其中，化合物2和化合物4的结构如下：3. 如权利要求2所述的巧光传感器的制备方法，其特征在于，化合物2、化合物5与催化 剂S乙胺的摩尔比为1.2:1:2。4. 如权利要求2所述的巧光传感器的制备方法，其特征在于，反应时间为2-化。5. 如权利要求2所述的巧光传感器的制备方法，其特征在于，有机溶剂选自乙醇，甲醇， 乙腊，二氯甲烧中的任一种。6. 如权利要求2所述的巧光传感器的制备方法，其特征在于，硅胶柱分离中的洗脱液采 用MeOH:C也Ch=I :99的混合液。7. 如权利要求1-6任意所述的巧光传感器在检测生物体谷脫甘肤中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种基于罗丹明B的GSH荧光传感器、制备及应用，以罗丹明B为前体合成目标产物N？-（2？-（3’，6’-双（二乙基氨基）-？3？-氧代螺[异二氢吲哚-1,9ˊ-呫吨]-2-乙基）-3,5-双（2，5-二氧-？3,4-二氢吡咯）苯甲酰胺。本发明提供了目标产物对谷胱甘肽检测的应用，发现其对谷胱甘肽有很好的检测效果，同时，本发明采用的原料易得，合成步骤简单，后处理亦很方便，较易实现大规模生产。
【IPC分类】C07D491/107, G01N21/64, C09K11/06
【公开号】CN105647523
【申请号】
【发明人】包晓峰, 吴小磊, 舒海, 曹乾升, 史加新
【申请人】南京理工大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月31日