小分子多肽Prdx5截短体及其载体和应用

小分子多肽Prdx5截短体及其载体和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及小分子多肽Prdx5截短体及其载体和应 用。
【背景技术】
[0002] 长久以来抗肿瘤药物是被广泛关注和研究的热点问题之一。目前对肿瘤或癌症的 治疗，通常是采用手术治疗结合放疗和化疗的综合疗法。放射线和化疗药导致细胞凋亡，从 而杀伤肿瘤细胞。高剂量的放疗和化疗药物可以破坏或消灭癌细胞，但同时也损害正常细 胞，使患者免疫功能下降，对人体造成一系列毒副作用。
[0003] 多肽药物是目前生物医药领域中极具发展前景的崭新领域，以其高效、安全、特异 性强等特点逐渐用于癌症的预防和治疗。基因的功能最终要通过其表达产物一一蛋白质来 实现，生物体的一切活动或功能都离不开蛋白质的物质基础。发现和鉴定具有重要功能的 蛋白质，可为新药的开发带来决定性的影响。
[0004] 基于肿瘤的发生发展及治疗预后的机制研究中，除了传统的原癌抗癌基因外，目 前关于活性氧(reactive oxidative species，R0S)在肿瘤生物学中的作用是一个热点的 研究领域。R0S在各类细胞中不断的产生和清除，发挥着其正常及病理的功能作用。Nrf2在 维持细胞的R0S相对稳态上发挥着重要的作用，R0S可通过Keapl第151位半胱氨酸的氧化 修饰，改变Keapl的构象从而释放Nrf 2，使得Nrf 2脱离泛素降解状态，进而入核并结合于下 游多个基因的启动子区域的抗氧化反应元件，调节抗氧化靶基因 NQ01、GSTs及HM0X1等转录 表达，降低R0S的水平。
[0005] 许多实验研究发现，在肿瘤组织（包括肺癌，肝癌，乳腺癌，卵巢癌等）中Nrf2和 Prdx5基因高表达，同时又发现其高表达导致现有的抗肿瘤药物无效。

【发明内容】

[0006] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种小分子多肽 Prdx5截短体，具有抗肿瘤功能，满足生物医药使用需求。本发明的另一目的是提供一种上 述小分子多肽Prdx5截短体的表达载体。本发明还有一目的是提供上述小分子多肽Prdx5截 短体的应用。
[0007] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为： 小分子多肽Prdx5截短体，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008] 所述的小分子多肽Prdx5截短体的编码基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0009]含有所述的小分子多肽Prdx5截短体的编码基因的载体。
[0010]所述的小分子多肽Prdx5截短体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0011]有益效果：与现有技术相比，本发明研制开发出靶向作用在Nrf2上的新型小分子 多肽Prdx5截短体，该多肽分子量小，穿透性能好;可在原核表达系统中表达，生产成本低； 具有很好的稳定性，能在一定范围内耐受酸碱度和温度的变化。
【附图说明】
[0012] 图1是Nrf2和Prdx5全长蛋白的相互作用及免疫沉淀结果图； 图2是小分子多肽Prdx5截短体的编码基因载体质粒图； 图3是Prdx5与Nrf2相互作用的结构域图； 图4是干扰小分子多肽Prdx5截短体表达后对细胞转移的影响结果图。 具体实施方案
[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0014] 实施例1 材料:Protein A/G beads，细胞裂解液，Nrf2抗体，Prdx5抗体，IgG。
[0015] 方法:细胞予预冷的0.01M PBS洗涤2次;加入lmL PBS后，细胞刮冰上刮取细胞，移 至1.5mL离心管中，1000g X 5min离心收集细胞;加入配置好的500yL细胞裂解液置于轮转仪 上4°C轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4°C离心10min，将上清液转移至新EP管。预澄清加 入20yL混勾的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时，900g离心5min(4°C)，将上 清液转移至新离心管，弃珠子。取40_60yL上清液作为Input，加入等量2 XSDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。其余部分平分为两等分，分别加入等量（lyg)Normal IgG或相应抗体，在DNA混合仪上转动2小时（4°C)。在每个离心管中各加入30yL混匀的 Protein A/G beads继续转动2小时。然后900g离心5min(4°C)，弃上清。加入lmL洗涤缓冲 液洗涤珠子。900g离心5min(4°C)，共洗涤3次。最后将40_60yL 2XSDS loading buffer加 入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。连同Input样品一起进行Western blot检 测。
[0016] 实验结果如图1所示:在组织IP和细胞IP中均存在Nrf 2和Prdx5全长蛋白的相互作 用。
[0017] 实施例2 本发明提供一种能抑制Nrf2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽。所述小分子多 肽由自行设计的基因编码，经聚合酶链反应(PCR)合成后插入表达质粒。将表达载体转入大 肠杆菌BL21，在LB培养基中培养，37 °C下诱导表达。破菌取上清，应用OMEGA公司的DNA抽提 试剂盒获得纯化的目的DNA，命名为Prdx5;其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，对应的编码 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。具体构建过程如下： 1)表达载体的构建:设计引物，经PCR法连接，通过限制性内切酶Hind III和Κρη I双酶 切后，插入p3XFLAG-Myc-CMV质粒，如图2所示。构建的表达载体经酶切鉴定正确。
[0018] 材料:E.coli BL21/DE3工程菌株为本室冻存;T4 DNA连接酶为Gibco BRL公司产 品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶为Promega公司产品；质粒提取试剂盒 购自北京博大泰克生物技术公司；Ni离子亲和层析介质购自本元正阳公司；胎牛血清 (FCS)、DMEM培养基、1640培养基为Hyc 1 one公司产品。
[0019] 方法表达载体的构建 基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成，引物序列如下： 上游引物：5 ' -CCAAGCTTACCATGTCCAAGACACACCTGCC-3 ' ； 下游引物：5 ' -GGGGTACCGAAAGCTGTGAGATGATATTGGGTGCC-3 '。
[0020] PCR反应体系为:H20 22yL，上游引物lyL，下游引物lyL，PCMV-N-FLAG-PRDX5质粒 lyL，Taq DNA聚合酶25yL。
[0021] PCR反应条件为:94°C变性4min，55°C退火，72°C引物延伸。
[0022] 在基因片段两端设计了Κρη I和Hind III两个限制性酶切位点，双酶切连入 p3XFLAG-Myc-CMV 质粒。
[0023]连接体系为:H2010yL，T4连接酶 bufferlyL，T4连接酶2yL，FragmentlyL。
[0024] 另设对照组，不加 fragment，以H2O补足体积。PCR机中连接过夜。
[0025]用连接产物转化JM109感受态菌。转化步骤为：1) 100yL感受态菌置于冰水，加入 DNA 0.5yL，静置30分钟；2)42°C水浴2分钟;3)冰浴5分钟;4)加入不含抗生素的LB培养基， 37°C下，150 RPM震荡培养50分钟。5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37°C 孵箱培养过夜。6)挑选阳性克隆4个，分别接种于LB液体培养基，置37°C摇床震荡培养。
[0026] _载体的鉴定：1)用试剂盒提取阳性克隆质粒DNA2)用Hind III和Κρη I双酶切 鉴定质粒DNA，送上海桑尼生物技术公司测序。双酶切体系为:H2014yL，Green buffer2yL， DNA2yL，Hind IIIlyL，Kpn IlyL，37°C水浴4小时。2)在大肠杆菌中诱导表达:转化大肠杆菌 BL21/DE3,挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养12K3)纯 化:收集转化菌，加入solution I 250 uL，离心机13000R离心10min;加入solution II 250 uL，反复颠倒20次，呈拉丝状后离心机13000R离心10min;加入solution III 350 uL，离心 机 13000R离心 10min;加入DNA washing buffer 750 uL，离心机 13000R离心lmin;最后应用 OMEGA公司的DNA抽提试剂盒获得纯化的目的DNA。
[0027] 截短IP:将Prdx5截短体的表达载体转入肺癌细胞中，进行细胞免疫共沉淀，具 体实验步骤同实施例1。
[0028]实验结果如图3所示:Prdx5截短体与S0X2蛋白之间的相互作用。其中除了Prdx5全 长蛋白（wt)能与S0X2蛋白相互作用外，Prdx5截短突变体(2)也能与S0X2蛋白发生相互作用 实施例3 材料:H1299细胞，无血清培养基，PBS，6孔板，marker笔，直尺，枪头。
[0029] 方法先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0 · 5~ lcm-道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5 X105个细胞，具体数量因细胞不 同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头 要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5%C0 2 培养箱，培养。按〇，6，12，24小时取样，拍照。
[0030] ?将转染Prdx5截短体的细胞和转染空载标签的细胞分别加入到六孔板中，实验 方法同上。
[0031] 实验结果如图4所示，野生型H1299细胞（左）和转染空载的H1299细胞（中）所表现 出来的转移情况要明显强于转染Prdx5截短体的H1299细胞(右），说明Prdx5的截短体能抑 制肿瘤细胞的转移。
【主权项】
1. 小分子多肽Prdx5截短体，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 权利要求l所述的小分子多肽PrdX5截短体的编码基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所 不。3. 含有权利要求2所述的小分子多肽Prdx5截短体的编码基因的载体。4. 权利要求1所述的小分子多肽Prdx5截短体在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种小分子多肽Prdx5截短体及其载体和应用，小分子多肽Prdx5截短体，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明研制开发出靶向作用在Nrf2上的新型小分子多肽Prdx5截短体，该多肽分子量小，穿透性能好；可在原核表达系统中表达，生产成本低；具有很好的稳定性，能在一定范围内耐受酸碱度和温度的变化。
【IPC分类】A61P35/00, A61K38/16, C07K14/00, C12N15/11
【公开号】CN105646676
【申请号】
【发明人】沈爱国, 季俐俐, 薛群, 汪志文
【申请人】南通大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月17日