一种纯化戈那瑞林的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种戈那瑞林的纯化方法，尤其是涉及一种成本低、污染少、效率高， 适合工业化纯化戈那瑞林的方法。
【背景技术】
[0002] 戈那瑞林，其化学名为5 ' 一氧代脯氨酰-L-组氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨 酰-甘氯酰_L_精氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰胺，其结构式：
戈那瑞林可刺激垂体前叶合成和释放黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，据此可探 测垂体促性腺激素储备功能。正常人注射戈那瑞林后，LH的升高明显，高于FSH，青春期前女 性FSH反应高于LH;促性腺激素释放素不足者注射后可出现延迟反应，有时需静脉滴注本品 数天后才能有所反应。如模拟下丘脑分泌促性腺激素释放素在正常情况下的分泌节律，用 小剂量脉冲式给药，戈那瑞林可治疗因下丘脑疾病导致的青春期发育延缓、闭经和不育;但 是，如果采用大剂量连续给药，则垂体促性腺激素在短期兴奋后出现反常作用，反而抑制垂 体-性腺功能。戈那瑞林可用于下丘脑-垂体病变所致的性腺功能低下的诊断；垂体肿瘤手 术或者放射治疗后残留垂体促性腺激素功能的评估;治疗促性腺激素释放激素不足，伴继 发性垂体促性腺激素功能低下所致的女性闭经、不孕，男性不育；因下丘脑疾病导致的青春 期发育延缓等。
[0003] 目前有关戈那瑞林纯化报道方法是使用离子色谱和反相色谱二步纯化分离tBOC 合成戈那瑞林。由于离子色谱预处理很麻烦且纯化过程不易控制，另外反相色谱使用三氟 乙酸体系二次纯化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一条适于大规模工业化生产的纯化戈那瑞林的方法，主要 解决该产品生产过程中粗肽纯度低，产品不易控制、收率不高等问题。本发明利用SPE柱初 分戈那瑞林粗品，上样量大而且可以达到有效的分离。该方法节省大量溶解、收率高，一般 在60~80%。本发明创新性在于先利用SPE(固相萃取)柱进行分离，然后采用反相高效液相 色谱梯度洗脱分离纯化，最后利用色谱法转盐，适合产业化生产。
[0005] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 一种纯化戈那瑞林的方法，包括如下步骤： 1)将戈那瑞林粗品先经SPE柱进行梯度洗脱纯化，先用体积百分比10%乙腈+体积百分 比0.1 %TFA(三氟乙酸)水溶液洗脱，然后用体积百分比40%乙腈+体积百分比0.1%TFA水溶液 洗脱，收集目的峰值的肽溶液； 2) 将步骤1)中收集的目标肽溶液经反相高效液相色谱柱进行梯度洗脱纯化，流动相A 为体积百分比〇. 〇 1-0.5%磷酸水溶液，流动相B为色谱级乙腈，梯度洗脱为B%(体积百分比）： 15%-55%，收集目标峰的肽溶液； 3) 将目标峰肽溶液利用HPLC转盐法转盐，流动相A为体积百分比0.05-0.3%醋酸水溶 液，流动相B为色谱级乙腈，梯度为5%的恒梯度冲洗10-25分钟，然后用醋酸水溶液和乙腈体 系洗脱，洗脱梯度为10%_70%，收集醋酸戈那瑞林肽溶液;4)减压旋蒸上述肽溶液浓缩冷冻 干燥得到醋酸戈那瑞林。
[0006] 更为优选的方案是:上述步骤1)中SPE柱为HyperSep PEP或者MCX SPE柱。
[0007]更为优选的方案是:上述步骤3)中色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶。
[0008]更为优选的方案是:上述步骤3)流动相A为体积百分比0.1%醋酸水溶液。
[0009] 本发明的有益效果是:本发明利用SPE柱分离纯化戈那瑞林粗品肽，价格便宜，操 作方便。不仅有效的分离纯化戈那瑞林粗品，达到一定的分离效果，从而保护反相高效液相 色谱柱。同时利用HPLC二次纯化并采用色谱法转盐，即能得到HPLC纯度大于98.0%的精肽， 而且提高收率5%，上样量提高10%，降低了成本，找到了一条适于产业化戈那瑞林的纯化方 法。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明产品色谱图。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 1.样品处理 称量5g戈那瑞林粗品加入体积百分比5%乙腈超声溶解至液体澄清，用孔径为0.45um滤 膜过滤后收集滤液备用。
[0012] 2. -次纯化 色谱柱：SPE柱。纯化过程:将上述滤液上样SPE柱，SPE柱为HyperSep PEP，先用体积百 分比10%乙腈+体积百分比0.1%TFA水溶液洗脱，然后用体积百分比40%乙腈+体积百分比 0.1%TFA水溶液洗脱，收集目的峰值的肽溶液.把收集的馏分用减压旋蒸浓缩至40-50mg/mL 备用。
[0013] 3.二次纯化 色谱柱:C18色谱柱，柱子直径和长度为：50cm X 25cm。流动相:流动相A为体积百分比 0.01-0.5%磷酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈，梯度洗脱为B%: 15%-55%。流速:80-100ml/ min。检测波长：220nm。纯化过程：用体积百分比90%乙腈冲洗色谱柱干净后，15%B平衡 lOmin上样，上样量为40-60mL样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目标产物。把收集的目标 产物合格部分合并后减压旋蒸浓缩至约60_80mg/mL备用。
[0014] 4.转盐 色谱柱:C18色谱柱，柱子直径和长度为：50cm X 25cm。流动相:流动相A为体积百分比 0.1%醋酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈。流速:80-100ml/min。检测波长:220nm。转盐过程： 用体积百分比90%乙腈冲洗色谱柱干净后，梯度5%B的恒梯度冲洗10-25分钟，上样后用醋酸 水溶液和乙腈体系洗脱，上样量为60-80mL，洗脱梯度为10%-70%，收集戈那瑞林溶液。将转 盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至80-100mg/mL，浓缩温度不超过35°C，然后冷冻干 燥得纯度大于98.0%的戈那瑞林，纯化收率77.2%。产品色谱图见图1。
[0015] 实施例2 1.样品处理 称量15g戈那瑞林粗品加入体积百分比5%乙腈超声溶解至液体澄清，用孔径为0.45um 滤膜过滤后收集滤液备用。
[0016] 2. -次纯化 色谱柱:SPE柱。纯化过程:将上述滤液上样SPE柱，为MCX SPE柱，先用体积百分比10%乙 腈+体积百分比〇. 1%TFA水溶液洗脱，然后用体积百分比40%乙腈+体积百分比0.1%TFA水溶 液洗脱，收集目的峰值的肽溶液.把收集的馏分用减压旋蒸浓缩至40-50mg/mL备用。
[0017] 3.二次纯化 色谱柱:C18色谱柱，柱子直径和长度为：100cm X 25cm。流动相:流动相A为体积百分比 0.01-0.5%磷酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈，梯度洗脱为B%: 15%-55%。流速：180-200ml/ min。检测波长:220nm。纯化过程:用体积百分比90%乙腈冲洗色谱柱干净后，15%B平衡lOmin 上样，上样量为200_250mL样品溶液。线性梯度洗脱80min，收集目标产物。把收集的目标产 物合格部分合并后减压旋蒸浓缩至约60_80mg/mL备用。
[0018] 4.转盐 色谱柱:C18色谱柱，柱子直径和长度为：50cm X 25cm。流动相:流动相A为体积百分比 0.1%醋酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈。流速:80-100ml/min。检测波长:220nm。转盐过程： 用体积百分比90%乙腈冲洗色谱柱干净后，梯度5%B的恒梯度冲洗10-25分钟，上样后用醋酸 水溶液和乙腈体系洗脱，上样量为250-300mL，洗脱梯度为10%-70%，收集戈那瑞林溶液。将 转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至80-100mg/mL，浓缩温度不超过35°C，然后冷冻 干燥得纯度大于98.0%的戈那瑞林，纯化收率75.2%。产品色谱图见图1。
[0019] 实施例3 1.样品处理 称量25g戈那瑞林粗品加入体积百分比5%乙腈超声溶解至液体澄清，用孔径为0.45um 滤膜过滤后收集滤液备用。
[0020] 2. -次纯化 色谱柱：SPE柱。纯化过程:将上述滤液上样SPE柱，SPE柱为HyperSep PEP，先用体积百 分比10%乙腈+体积百分比0.1%TFA水溶液洗脱，然后用体积百分比40%乙腈+体积百分比 0.1%TFA水溶液洗脱，收集目的峰值的肽溶液.把收集的馏分用减压旋蒸浓缩至40-50mg/mL 备用。
[0021] 3.二次纯化 色谱柱:C18色谱柱，柱子直径和长度为：150cm X 25cm。流动相:流动相A为体积百分比 0.01-0.5%磷酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈，梯度洗脱为B%: 15%-55%。流速:450-500ml/ m i η。检测波长：2 2 0 n m。纯化过程：用体积百分比9 0 %乙腈冲洗色谱柱干净后，15 % B平衡 lOmin上样，上样量为500-600mL样品溶液。线性梯度洗脱lOOmin，收集目标产物。把收集的 目标产物合格部分合并后减压旋蒸浓缩至约60-80mg/mL备用。
[0022] 4.转盐 色谱柱:C18色谱柱，柱子直径和长度为：50cm X 25cm。流动相:流动相A为体积百分比 0.1%醋酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈。流速:80-100ml/min。检测波长:220nm。转盐过程： 用体积百分比90%乙腈冲洗色谱柱干净后，梯度5%B的恒梯度冲洗10-25分钟，上样后用醋酸 水溶液和乙腈体系洗脱，上样量为400_450mL，洗脱梯度为10%-70%，收集戈那瑞林溶液。将 转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至80-100mg/mL，浓缩温度不超过35°C，然后冷冻 干燥得纯度大于98.0%的戈那瑞林，纯化收率74.6%。产品色谱图见图1。
【主权项】
1. 一种纯化戈那瑞林的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将戈那瑞林粗品先经SPE柱进行梯度洗脱纯化:先用体积百分比10%乙腈+体积百分 比0.1 %三氟乙酸水溶液洗脱，然后用体积百分比40%乙腈+体积百分比0.1 %三氟乙酸水溶液 洗脱，收集目的峰值的肽溶液； 2) 将步骤1)中收集的目标肽溶液经反相高效液相色谱柱进行梯度洗脱纯化:流动相A 为体积百分比〇. 01-0.5%磷酸水溶液，流动相B为色谱级乙腈，梯度洗脱为B%: 15%-55%，收集 目标峰的肽溶液； 3) 将目标峰肽溶液利用HPLC转盐法转盐：流动相A为体积百分比0.05-0.3%醋酸水溶 液，流动相B为色谱级乙腈，梯度为5%的恒梯度冲洗10-25分钟，然后用醋酸水溶液和乙腈体 系洗脱，洗脱梯度为10%_70%，收集醋酸戈那瑞林肽溶液； 4) 减压旋蒸上述肽溶液浓缩冷冻干燥得到醋酸戈那瑞林。2. 根据权利要求1所述的一种纯化戈那瑞林的方法，其特征在于:所述步骤1)中SPE柱 为HyperS印 PEP或者MCX SPE柱。3. 根据权利要求1所述的一种纯化戈那瑞林的方法，其特征在于:所述步骤3)中色谱柱 固定相为十八烷基键合硅胶。4. 根据权利要求1所述的一种纯化戈那瑞林的方法，其特征在于:所述步骤3)流动相A 为体积百分比〇. 1%醋酸水溶液。
【专利摘要】本发明的目的在于提供一条适于大规模工业化生产的纯化戈那瑞林的方法，主要解决该产品生产过程中粗肽纯度低，产品不易控制、收率不高等问题。本发明的技术方案为：戈那瑞林经SPE柱和反相色谱柱进行梯度洗脱纯化，得到较高纯度的戈那瑞林馏分，然后采用HPLC转盐法转盐，减压旋蒸、浓缩、冷冻、干燥得到醋酸戈那瑞林。本发明用于工业化纯化戈那瑞林。
【IPC分类】C07K1/20, C07K7/23
【公开号】CN105646671
【申请号】
【发明人】徐红岩, 秦敬国
【申请人】吉尔生化（上海）有限公司, 上海吉尔多肽有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月25日