一种红曲霉菌体ace抑制肽的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽物质纯化技术领域，具体涉及一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法。
【背景技术】
[0002]随着社会发展和人们生产、生活水平的提高，人口平均年龄增长，饮食结构改变，盐摄入量增高，以致高血压、高血压性心脏损害患病率增加。高血压不仅是一个独立的疾病，也是脑中风、冠心病、肾功能衰竭和眼底病变的重要危险因素，高血压患者还常常伴有糖尿病等慢性疾患，因此，有效地预防并控制高血压对人体健康具有重要意义。
[0003]降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(Ang1ensin I Converting Enzyme，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的短链多肽物质。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。
[0004]红曲霉菌丝体ACE抑制肽为使用包括胃蛋白酶在内的复合蛋白酶酶解天然食源性物质红曲霉所得的一类小分子多肽物质。已有研究表明红曲霉固态发酵产物红曲米的浸提物具有较好的ACE抑制活性，并且可以从浸提物中分离出具有ACE抑制活性的小分子多肽。目前，基于ACE抑制活性的降血压药物主要是卡托普利，依那普利等化学合成类药物，对人体有一定的副作用，若能将天然的ACE抑制活性多肽应用于降血压药物或保健品中，前景将十分广泛，市场潜力巨大。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种条件温和，所得红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分纯度高且活性强的红曲霉菌丝体ACE抑制肽的纯化方法。
[0006]为实现本发明的目的，发明人通过大量实验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案:
一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，该方法包括以下步骤:
(1)红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉的复溶:将真空冷冻干燥得到的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用PBS缓冲液进行复溶，PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5;
(2)柱层析分离菌丝体ACE抑制肽:对复溶后的红曲霉菌丝体ACE抑制肽溶液进行离心，3000r/min条件下离心5min，收集上清液后使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用葡聚糖凝胶柱层析，收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰；
(3)活性组分峰的富集:将步骤(2)收集的各组分收集液冷冻干燥后使用PBS缓冲液配成相同浓度，分别测定各组分的ACE抑制活性，PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5;
(4)RP-HPLC分离菌丝体ACE抑制肽:对步骤(3)中具有最高ACE抑制活性的组分E进行离心，3000r/min条件下离心5min，收集上清液后再使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用RP-HPLC进行进一步分离，条件为:进样量1mL，柱温25 V，流动相为超纯水，流速5mL/min，蛋白检测波长为220nm ；
(5)RP-HPLC活性组分峰的富集:收集组分E经RP-HPLC分离所得的各活性组分峰，将各组分收集液冷冻干燥后使用PBS缓冲液配成相同浓度，并分别测定各组分的ACE抑制活性，?83缓冲液的浓度为10臟01/1，？!1为7.3-7.5。
[0007]优选地，如上所述的一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，其中步骤(2)中所述的葡聚糖凝胶柱层析为GE公司superdex 30pg葡聚糖凝胶柱，层析条件为:进样量10mL，柱温25°C，流动相为超纯水，流速lmL/min，蛋白检测波长为280nm。
[0008]优选地，如上所述的一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，其中步骤(3)、(5)中所述的ACE抑制活性测定的方法为:样品溶于超纯水，离心(7200 X g，15min)，取上清液1yL和40yL 2.17!111]101凡底物(11丨。。1^71-1^-]^8?611溶于。!18.3 0.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3 mol/L NaCl)于37°C保温6min，加入20yL ACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37°C下反应30min后，加入80yL ImoI/L的HCl溶液终止反应，至室温取1yL反应产物进样。
[0009]本发明具有以下的有益效果:本发明采用柱层析和半制备级高效液相色谱的方法分离纯化红曲霉液态发酵的菌丝体ACE抑制肽，针对红曲霉菌丝体ACE抑制肽分子量大小和所带电性的不同，有针对性的对红曲霉菌丝体ACE抑制肽中的各个活性组分进行分离纯化。本发明操作简单、具有纯化分离度高、活性组分损失少和纯化所得组分降血压活性高的优点。
【附图说明】
[0010]
图1为实施例1红曲霉菌丝体ACE抑制肽经superdex 30pg葡聚糖凝胶柱层析分离的洗脱图谱。
[0011 ] 图2为实施例1中ACE抑制肽经superdex 30pg分离后活性组分A-E所对应的ACE抑制率。
[0012]图3为实施例1ACE抑制肽活性组分E经RP-HPLC分离的洗脱图谱。
[0013]图4为实施例1中ACE抑制肽经RP-HPLC分离后活性组分E1-E5所对应的ACE抑制率。
【具体实施方式】
[0014]以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0015]实施例1
将真空冷冻干燥得到的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5的PBS缓冲液进行复溶，其中红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉采用中国专利CN105002249A(一种红曲霉液态发酵制备具有ACE抑制活性多肽的方法)中所述的方法制备。
[0016]对复溶后的ACE抑制肽溶液在3000r/min条件下离心5min，收集上清液，使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液使用GE公司superdex 30pg葡聚糖凝胶柱层析分离以收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰(图1)，柱层析进样量1mL，柱温25 V，流动相为超纯水，流速lmL/min，蛋白检测波长为280nm。
[0017]收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰，共得到5个组分峰，编号为组分A-E，将各组分收集液冷冻干燥后使用浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5的PBS缓冲液配成lmg/mL的溶液，离心(7200 Xg, 15min)，取上清液1yL和40yL 2.17mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于PH8.3 0.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3 mol/L NaCl)于37°C保温6min，加入20yLACE(0.1U溶于1.011^相同的缓冲溶液中)，37°(:下反应301^11后，加入80yL lmol/L的HCl溶液终止反应，至室温取1yL反应产物进样。
[0018]测定结果(图2)浓度为lmg/mL的组分A-E对应的ACE抑制率分别为30.6%，40.2%，43.1%，18.9%，70.1%;具有最高的ACE抑制活性的组分E在3000r/min条件下离心5min，收集上清液，使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用RP-HPLC进行进一步分离，分离条件为使用Shim-pack PRC-ODS色谱柱，进样量1mL，柱温25°C，流动相为超纯水，流速5mL/min，蛋白检测波长为220nmo
[0019]组分E经RP-HPLC分离所得的活性组分峰(图3)，共得到5个组分峰，编号为组分El-已5，将各组分收集液冷冻干燥后使用浓度为1011111101/1，？!1为7.3-7.5的？83缓冲液配成
0.lmg/mL的溶液，并采用同样的测定方法分别测定各组分的ACE抑制活性。
[0020]测定结果(图4)浓度为0.1mg/mL的组分E1-E5对应的ACE抑制率分别为37.2%，50.2%,55.7%,54.8%,41.5%。
【主权项】
1.一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，其特征在于:该纯化方法包括以下步骤: (1)红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用PBS缓冲液进行复溶； (2)对复溶后的ACE抑制肽溶液进行离心，离心条件为3000r/min、5min，收集上清液后使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤，所得滤液采用葡聚糖凝胶柱层析，收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰； (3)将步骤(2)收集的各组分收集液冷冻干燥后使用PBS缓冲液配成相同浓度，分别测定各组分的ACE抑制活性； (4)对步骤(3)中具有最高ACE抑制活性的组分E进行离心，离心条件为3000r/min、5min，收集上清液后再使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用RP-HPLC进行进一步分离，条件为:进样量1mL，柱温250C，流动相为超纯水，流速5mL/min，蛋白检测波长为220nm; (5)收集组分E经RP-HPLC分离所得的各活性组分峰，将各组分收集液冷冻干燥后使用PBS缓冲液配成相同浓度，并分别测定各组分的ACE抑制活性。2.如权利要求1所述的一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，其特征在于:步骤(2)中所述的葡聚糖凝胶柱层析条件为:进样量1mL，柱温25°C，流动相为超纯水，流速lmL/min，蛋白检测波长为280nmo
【专利摘要】本发明公开了一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，属于多肽物质纯化技术领域。采用柱层析和半制备级高效液相色谱的方法分离纯化红曲霉液态发酵的菌丝体ACE抑制肽，具体步骤为红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉的复溶、柱层析分离菌丝体ACE抑制肽、活性组分峰的富集、RP-HPLC分离菌丝体ACE抑制肽、RP-HPLC活性组分峰的富集。使用该纯化方法得到的红曲多肽活性组分具有较好的降血压功效，具有开发降血压保健食品的潜力，同时本发明的方法具有纯化分离度高、操作简单、活性组分损失少和纯化所得组分降血压活性高的优点。
【IPC分类】C07K1/36, C07K1/16, C07K1/34
【公开号】CN105646646
【申请号】
【发明人】王伟平, 成细瑶, 胡川, 鲁江
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月17日