的相关性验证了 上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图 2)〇
[0025]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027] PC12细胞株，安徽中医学院实验中心赠与。Ah-4〇蛋白购于Sigma公司。化合物（I) 为自制，HPLC归一化纯度大于98%<^ΜΕΜ/Ρ12培养基(进口分装购于北京赛默飞世尔生物化 学制品有限公司。Newborn Calf Serum购于Beijing Solarbio Science&Technology Co.， LtcLMTT购于美国Amresco公司。凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生 物技术有限公司。多聚甲醛购于中国医药集团化学试剂有限公司。Bcl-2多克隆抗体购于武 汉博士德生物技术有限公司。Bax多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。Cyt-c多 克隆抗体购于武汉博士德生物技术有限公司。羊抗兔IgG/FITC购于北京博奥森生物技术有 限公司。羊抗鼠 IgG/(H+L)购于江苏碧云天生物公司。正常山羊血清购于武汉博士德生物技 术有限公司。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒购于 武汉博士德生物技术有限公司。
[0028]电子分析天平(FA2004型，上海雷磁精密科学仪器公司），水浴锅(HH · SI1-4型，北 京医疗器械厂），酶标仪（ELx-800型，美国Bio-Tek)，流式细胞仪（EPIC XL-MCL型，美国 Beckman Couiter公司），高速冷冻离心机(3K30型，美国Sigma公司，二氧化碳培养箱(C0-150型，美国NBS有限公司），0LYMPUS荧光显微镜（BX41型，带DP70摄像系统，日本Olympus公 司产品）。
[0029]二、试验方法
[0030] 1、Aft-4〇孵育
[0031] Ah-4〇用去离子水配制成ΙΟΟΟμ mol/L储存液并分装，放置于冰箱-20°C储存，临用 用前一周取出在37°C培养箱孵育7d，使之聚集老化。
[0032] 2、细胞的培养
[0033] PC12细胞株用含10%胎牛血清、1001]/而青霉素、1001]/11^链霉素的01^1/^12培养 基在玻璃培养瓶中培养，C02细胞培养箱的培养条件为37 °C，5 % C02浓度，饱和湿度，待细胞 长至80%丰度后用0.25%的胰酶消化传代1次(约2-3d)，倒置显微镜观察细胞生长状况，实 验时取对数生长期细胞进行实验。进行MTT实验前将细胞接种到96孔培养板用无血清培养 基培养;流式细胞仪检测前将细胞接种至6孔培养板用无血清培养既培养;免疫组化实验均 用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。
[0034] 3、细胞给药处理及分组
[0035]细胞共分为五组，无血清培养基接种24h后进行药物干预：①正常对照组：正常 PC12细胞;②模型组:25ymol/LAfo-4〇;③化合物（I)低剂量组:25ymol/LAfo-4〇+50mg/L化合物 (I);④化合物⑴中剂量组:25以111〇1/1她-4Q+100mg/L化合物（I);⑤化合物⑴高剂量组:25 ymol/LAfo-4〇+200mg/L化合物（I)。药物处理24h后进行检测各项指标。
[0036] 4、MTT检测各组细胞活力
[0037]取对数生长期的细胞，胰酶消化后以IX 105个/mL的细胞密度，每孔100yL接种于 96孔板中无血清培养24h，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，24h后， 每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL继续在C0 2细胞培养箱中孵育4h，然后取出96孔培养板，弃 去上清液，每孔加入150yL的DMSO，放在摇床上振荡1 Omin，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪 在490nm波长处检测各孔的吸光值。以只加培养液的孔为调零参照，细胞活力用百分比表 达，视对照组的细胞活性为100%。结果计算：细胞存活率=(实验组0D值-空白对照组0D 值)/(对照组0D值-空白对照组0D值）X 100%。
[0038] 5、统计分析
[0039]采用SPSS17.0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数 士标准差(S±S)表示，组间采用LSD比较，P〈0.05为具有显著性差异，P〈0.01为极其显著性 差异，图表由Excel 2003绘制。
[0040] 三、结果及结论
[0041] MTT测试结果显示，与正常组细胞比较，模型组细胞活性明显降低(P〈0.01)，化合 物（I)干预后细胞活性有所提高，其中高、中剂量组细胞活性的升高具有统计学意义（P〈 0.01，P〈0.05)，低剂量组细胞活性改变不大(P>0.05)。见表1 (与模型组比较*P〈0.05，**P〈 0·01)〇
[0042] 结论，本研究证实Afo-40的毒性损害神经细胞，引起PC12大量凋亡，细胞活性下降， 化合物（I)干预后凋亡情况得到改善。
[0043] 表1 MTT法化合物⑴对她-4〇诱导PC12细胞活性的影响（i±s，n = 6)
[0045] 实施例3
[0046] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0047] 实施例4
[0048] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0049] 实施例5
[0050] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0051 ] 实施例6
[0052]注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0053] 实施例7
[0054] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0055] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，O2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将金较 石解的干燥茎粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用 75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步 骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、55:1、25:1、10:1和1:1 的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次 用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2 用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收 集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述用乙醇热回流提取 采用的乙醇浓度为85 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备神经保护药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备神经保护药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的环金合欢烷型倍半萜类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的环金合欢烷型倍半萜类化合物，可以从金钗石斛的干燥茎中提取、分离纯化得到。体外试验证明Aβ1-40的毒性损害神经细胞，引起PC12大量凋亡，细胞活性下降，该化合物干预后凋亡情况得到改善，可以用来开发成神经保护的药物。
【IPC分类】A61P25/00, A61K31/365, C07D307/58
【公开号】CN105646406
【申请号】
【发明人】叶胜, 姚思梦, 李新, 钱元
【申请人】安徽理工大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月29日