异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得苯甲酰胺类人pde4b抑制剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明技术领域为酶抑制剂类药物，涉及异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得 苯甲酰胺类结构及其抑制人磷酸二酯酶4B活性;代表化合物具有较强的抑制活性和抗炎活 性。
【背景技术】
[0002] 3,5_环磷酸腺苷(cAMP)和3,5_环磷酸鸟苷(cGMP)是哺乳动物细胞中关键的第二 信使，调节细胞功能；其体内降解的唯一途径是磷酸二酯酶（cycl ic nucleotide phosphodiesterase(PDE))催化的水解。炎性细胞和免疫细胞中以磷酸二酯酶同工酶4 (PDE4)为主，PDE4可专一性水解cAMP，在嗜中性粒细胞、单核细胞、T细胞、支气管平滑肌细 胞中主要表达亚型为roE4B[Proc Natl Sci USA.2002,99(11) :7628-7633] JDE4B已成为 抗炎药物设计和筛选的靶点，其抑制剂可以用于治疗由炎症引起的慢性疾病，如哮喘、慢性 阻塞性肺疾病（C0PD)等[Phosphodiesterases as Drug Targets(Springer，Be;rlin)， 2011]。目前罗氟司特(roflumilast，商品名daliresp)已成功用于临床治疗慢性阻塞性肺 炎、急性呼吸窘迫综合征以及哮喘，但仍有腹泻、恶心、房颤及失眠等副作用[Expert Opin Investig Drugs 2015,24(12):1597-1611]。
[0003] 咯利普兰(Rolipram)是最早发现的TOE4抑制剂，由于严重的副反应仅作为研究试 剂，但以此为先导结构成功发现了 TOE4强效抑制剂罗氟司特及RP73401。咯利普兰含异香兰 酸酰胺母核结构即3,4_二烷氧基苯甲酰胺，此类化合物易于合成，母核部分不含手性结构； 现有TOE4B抑制剂大多有手性碳原子或复杂杂环结构，制备难度大;改变异香兰酸酰胺的氨 基端结构并调节异香兰酸3,4_位取代基是设计新型PDE4抑制剂的重要思路。通过筛选，发 现用饱和小环对应胺与异香兰酸衍生物缩合的酰胺，也有很好的PDE4抑制作用和一定的抗 炎活性。
【发明内容】
[0004] 1.异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得苯甲酰胺类人PDE4B抑制剂，结构特征 如下：
[0005]
[0006] 2.按权利要求1所述异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得苯甲酰胺类人PDE4B 抑制剂，对人磷酸二酯酶4B抑制常数低于l.Ommol/L，对人单核细胞在脂多糖刺激下释放炎 症因子TNF-a有抑制作用。
[0007] 应用实施例
[0008] (一)本发明所涉及目标化合物的合成路线
[0009] 1. A类化合物合成参照文献(J.Med. Chem. 1994，37，1696-1703)，详见附图1，结构 及纯度数据分析见附表1。
[0010] 将异香兰素（7.6g，50mmol)加入到N，N-二甲基甲酰胺80毫升中，再加入溴代环戊 烧(9.78,65_31)和碳酸钾（10.48,75_31)，加热至100摄氏度，反应30小时，冷却至室温， 倒入饱和氯化铵溶液130毫升中，室温下搅拌10分钟，静置分层，水层用乙酸乙酯(3X100毫 升）萃取，有机萃取液合并，水洗，干燥，浓缩，得棕色油状物(9.4g，收率85 % )(文献:收率 87%)
[0011] 将3-(环戊氧基)-4-甲氧基-苯甲醛(98,40111111〇1)溶于40%氢氧化钾甲醇溶液(60 毫升)和30 %双氧水(60毫升）中，再加入四氢咲喃(20毫升)和氯化锌（1.4g，lOmmol)，升温 回流，反应40小时，冷却至室温，用氢氧化钠调至碱性(pH>10)，用氯仿（2X60毫升)洗涤， 水层用盐酸调至酸性(pH<3)，氯仿萃取，有机层合并，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得白色 粉末状固体3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯甲酸(5g，收率52.9%)
[0012] 将3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯甲酸（0.248，1111111〇1)和二环己基碳二亚胺（0.21 8， lmmol)置于10毫升三氯甲烧中，再加入胺类（lmmol)，加热至40摄氏度，反应24小时，减压除 去溶剂，经柱层析，得白色粉末状固体3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯甲酰胺(收率60-84%)
[0013] 2.B类化合物合成参照A类化合物，结构及纯度数据见附表1。
[0014] 参照文献（Chinese Journal of Pharmaceuticals 2011，42(12) :884-886):
[0015] 将4-二氟甲氧基-3-羟基苯甲醛(9.48,50謹〇1)，氯甲基环丙烷(68,66111111〇1)和碳 酸钾（10.4g，75mmol)加入60毫升丁酮，搅拌厚加少许碘化钾，回流反应2h，旋转蒸干溶剂， 二氯甲烷中水洗再蒸干溶剂得油状物4-二氟甲氧基-3-环丙甲氧基苯甲醛(10g，44mm 〇l，收 率 89%);
[0016] 将4-二氟甲氧基-3-环丙甲氧基苯甲醛溶于60毫升40 %氢氧化钾的甲醇溶液，加 入60毫升30 %双氧水，65摄氏度反应4h，用浓盐酸小心酸化至pH<2，析出固体（6g，收率 55%)
[0017]后续成酰胺参照A类化合物合成。
[0018](二)磷酸二酯酶的表达与纯化、活性测定
[0019]参照文献（J.Enzyme Inhibit.Med.Chem.，2014;29:836-839):
[0020] 1.磷酸二酯酶的表达与纯化
[0021] 将人全长磷酸二酯酶基因全开放的cDNAg隆到pReCeiVer-B13质粒，其限制性酶切 位点Hindlll和NotI，N端带6His标签，获得表达载体(pReceiver-B13-hroE4B2)。将质粒 (pReceiver-B13_Hpde4B2)转化到大肠杆菌BL21中16摄氏度诱导表达20-24小时。收集菌 株，加入裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl pH 8.0含400mmol/LNaCl，lmmol/L二硫苏糖醇， lmmol/L苯甲基磺酰氟，2mmol/L苯甲脒），冰浴4摄氏度时99W超声裂解至澄清，12000转/分 离心收集上清；
[0022] 镍柱纯化：用20mmol/LTris-HCl pH 8.0,400mmol/LNaCl，10-20倍柱体积平衡 (Ni-NTA)柱，上目的蛋白人全长磷酸二酯酶裂解上清，目的蛋白带6His标签能够特异性结 合到柱子里，杂蛋白大部分流出，用20mmol/LpH 8 .OTris-HCl，400mmol/LNaCl，30mmol/L咪 唑，10-20倍柱体积洗脱掉其他的非特异性吸附的杂蛋白，再用20mm 〇l/LTris-HCl pH 8.0， 400mmol/L咪唑洗脱特异性结合的目的蛋白，收集目的蛋白，用20mmol/L pH 8.0Tris-HCl 透析去除咪唑;按下述方法测定酶活性为30~60U/g。
[0023] 2.偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定磷酸二酯酶活性
[0024] 酶反应缓冲液为20臟〇1/11^8-!1(：1卩!17.4并含有10111111〇1/1]\%(：12和0.1111111〇1/1 乙二胺四乙酸。加入cAMP启动反应。用偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定磷酸二酯酶的 活性。磷酸二酯酶的一个活性单位定义为每分钟水解一微摩尔cAMP所对应的磷酸二酯酶的 量。
[0025]偶联终点法中，反应混合物溶液共1.35毫升，其中包括0.832毫升的酶反应缓冲 液、200微升磷酸二酯酶溶液、150微升适当稀释的碱性磷酸酶溶液(终浓度为30U/L，含甘油 28% )，混匀后加入162微升的cAMP溶液使其终浓度为60ymol/L(于260nm处用其吸收矫正） 启动反应、于室温反应20分钟后，加入250微升的40%的高氯酸终止磷酸二酯酶和碱性磷酸 酶的反应，然后13000转/分，离心10分钟以除去变性蛋白。
[0026]取0.7毫升上清（其中含6.3%的高氯酸、2.8%的甘油）加入130微升的孔雀绿 (1 .Ommol孔雀绿溶解于含0.16%聚乙稀醇的6mmol的浓硫酸溶液中）混勾，在2分钟之内加 入70微升的钼酸铵（50mmol的钼酸铵溶于3.4mol浓硫酸溶液)混匀后于30摄氏度反应20分 钟，在630nm处测定吸收，且630nm最大吸收不超过1 · 350 〇
[0027] 摩尔消光系数校正：用磷酸二氢钾溶于20mmol/L Tris-HCl pH 7.4含lOmmol/ LMgCl2和0. lmmol/L乙二胺四乙酸配成50mmol/L的磷酸标准溶液，配成0.5~10mmol/L浓度 在630nm的吸收对磷浓度成线性响应，其在酶反应缓冲液中的摩尔消光系数为(0.1136 土 0.003) X10-6M-Lm-Ηηζβ)。（附图2)
[0028] 3.米氏常数测定
[0029] 采用双倒数作图法，在测定磷酸二酯酶活性的优化条件下，改变底物cAMP的浓度， 用偶联碱性磷酸酶在相同酶量不同含量底物时测定酶的活性(且使A630 < 1.350)，双倒数 分析测定表观米氏常数Km;所得人全长磷酸二酯酶的1为8.5±0.3微摩尔(n = 3)(附图3)
[0030](三)化合物抑制活性测定
[0031 ]参照文献（J.Enzyme Inhibit .Med · Chem.，2014; 29:836-839)，化合物用二甲亚讽 溶解后用缓冲液稀释至不同浓度，采用偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定酶活性，使体 系二甲亚砜终浓度低于0.5%，底物cAMP浓度为60.Oymol/L，在不同抑制剂浓度时测定活性 并绘制活性对数浓度响应曲线，计算IC50，并结合K m计算抑制常数Ki。（附图4及附表2)
[0032] (四）代表化合物对脂多糖诱导TNF-α表达的抑制作用（附表2)
[0033] 根据文献(J Pharmacol Exp Ther 2009;330(3) :922-931)，用中性粒细胞分离液 提取健康人外周血单核细胞；用细胞培养液稀释并计数；于6孔板中每孔加入4 X 105个细 胞，加入终浓度为40ymol/L代表化合物，设阳性对照为40ymol/L rolipram，阴性对照为含 二甲亚砜的生理盐水，培养1小时后，加入100ng/mL的脂多糖培养8-16小时；分离上清用 ELISA方法测定TNF-α;与不加抑制剂的阴性对照比较，计算抑制率。
[0034]附图的说明：
[0035]附图1异香兰酸酰胺衍生物合成路线
[0036]附图2 630nm处测定的吸收对用孔雀绿定磷法测定无机磷的响应 [0037]附图3双倒数作图法预测Km
[0038] 附图4代表化合物抑制活性测定
[0039] 附表1.咕NMR结构解析和液相色谱纯度分析
[0040]
[0041 ] 液相色谱条件:HPLC-1100(安捷伦），SPD-10Avp(UVVIS检测器），反向极性柱:C18， 0DS;柱体积:4.6毫米X 250毫米，5微米;样品浓度:200微克/毫升;波长λ: 220-280纳米;洗 脱液:90%甲醇和10%水;洗脱速度:0.50毫升/分，柱温25摄氏度。
[0042]附表2代表化合物抑制活性及抗炎活性
【主权项】
1. 异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得苯甲酯胺类人PDE4B抑制剂，结构特征如下：2. 按权利要求1所述异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得苯甲酯胺类人PDE4B抑制 剂，对人憐酸二醋酶4B抑制常数低于l.Ommol/L，对人单核细胞在脂多糖刺激下释放炎症因 子TNF-a有抑制作用。
【专利摘要】异香兰酸衍生物与饱和小环胺缩合所得苯甲酰胺类人磷酸二酯酶4B抑制剂，其结构特征为：所述异香兰酸母核为3-环戊氧基-4-甲氧基苯甲酸和3-环丙甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲酸，对应饱和小环胺包括吗啉、四氢吡咯、环戊胺、环己胺；二者组合缩合而成酰胺化合物；其活性特征为人磷酸二酯酶4B的抑制剂，对人单核细胞在脂多糖刺激下释放炎症因子TNF-a有抑制作用。
【IPC分类】C07C235/54, A61K31/5375, C07C231/02, A61K31/4015, C07D295/192, A61P29/00, A61K31/166
【公开号】CN105646399
【申请号】
【发明人】杨晓兰, 何姝, 廖飞, 胡小蕾, 张祥, 陈春艳
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月18日