一种亚细胞结构疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗领域，具体涉及一种亚细胞结构疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤生物治疗发展迅速，目前有大量疫苗进入临床实验阶段，肿瘤疫苗包括肿瘤细胞疫苗，肿瘤相关抗原疫苗，核酸疫苗及相关活性免疫细胞疫苗等，但是由于免疫逃逸等因素，蛋白抗原或抗原肽等单一抗原成分的疫苗在临床上很难体现显著疗效。
[0003]肿瘤全细胞来源的肿瘤抗原组分多样，但是由于肿瘤细胞的自我保护机制完善，只能保留容易诱发免疫耐受的长寿蛋白抗原，且在自身免疫系统中很容易形成对这些抗原的耐受，缺乏目前研究认为的可诱导T细胞应答的短寿蛋白等组分。现有技术的自噬小体来源的亚细胞结构疫苗在动物实验中体现了一定的肿瘤抑制效果，但在临床应用中由于人体免疫机制及个体发病差异，自噬小体疫苗的临床效果仍有可提高的空间。
[0004]自噬小体疫苗可以有效的诱导CD8T效应细胞靶向杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。自噬小体疫苗主要是一种药物诱导肿瘤细胞而得到的亚细胞结构疫苗，我们用雷帕霉素或氯化铵诱导自噬形成，同时用蛋白酶体抑制剂抑制某些有效抗原蛋白的降解，从而富集得到一种具有双层膜结构，富含自噬小体，大小约100-900 nm的囊泡结构的疫苗。
[0005]目前的研究中，认为HSP704Q7-426具有一定的免疫活化功能，可以协助免疫系统对肿瘤抗原的识别和递呈，转化T细胞应答的类型等。不断增加自噬小体疫苗在现有工作中有限的抗肿瘤效果，提高免疫应答效率，是未来肿瘤疫苗研究需要解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的提供一种亚细胞结构疫苗制备方法，包括自噬小体疫苗的制备和HSP70407-426修饰，经过该方法制备的亚细胞结构疫苗比现有的自噬小体疫苗有更强的激活抗原特异性T细胞应答的能力，且具有更强的抑制小鼠肿瘤生长的能力。
[0007]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是这样的，1、一种亚细胞结构疫苗的制备方法，包括如下步骤:
步骤I，将经培养后的肿瘤细胞在含有氯化铵及硼替佐米的培养基中继续培养24-48小时，诱导自噬小体的形成;24-48小时后，收集全部的细胞培养物，4°C下先经1500rpm离心10分钟，去除大颗粒细胞杂质，收集离心上清;再将收集的上清经12000rpm离心15分钟;得到的沉淀经缓冲液洗涤，再次经12000rpm离心15分钟;收集沉淀并悬浮在缓冲液中，电镜下观察其结构为100-900nm的小泡结构，即为自噬小体疫苗；
步骤2，将自噬小体疫苗中的蛋白终浓度调整为lmg/ml，与浓度为lmg/ml化学合成的HSP704Q?-426肽段混合，缓慢加入戊二醛，持续搅拌下，在4°C中反应3-4小时；12000rpm离心15分钟去除上清中多余的戊二醛，得到的沉淀就是经过HSP70407-426修饰后的亚细胞结构疫苗;疫苗重悬在冻存保护液中，分装后冻存于_80°C冰箱或液氮中备用。
[0008]本发明还提供一种采用上述方法制备的亚细胞结构疫苗。
[0009]本发明制备的亚细胞结构疫苗强化抗原免疫原性原理为:硼替佐米及氯化铵为蛋白酶体抑制剂和自噬诱导剂，可以抑制溶酶体中蛋白酶对短寿蛋白的降解，而SLiPs、DRiPs作为MHC-1类抗原可以有效被抗原递呈细胞识别，交叉递呈至CD8+T淋巴细胞，诱导肿瘤抗原特异性CD8 + T淋巴细胞活化，在维持了肿瘤抗原优势的情况下，自噬小体疫苗再经HSP70407-426修饰后，HSP70407-426作为免疫激活分子，进一步加强抗肿瘤免疫应答的能力，达到更强的肿瘤生长抑制效果。
[0010]有益效果:本发明的抗肿瘤的亚细胞结构疫苗是基于以硼替佐米及氯化铵诱导肿瘤细胞内短寿蛋白和缺损的核糖体产物作为抗原蛋白，这些抗原通过自噬途径进入双层膜结构的自噬小体，收集分泌至胞外的自噬小体而得到自噬小体疫苗，经HSP704Q7-426修饰后，得到本发明的亚细胞结构疫苗，其比现有的自噬小体疫苗有更强的激活抗原特异性T细胞应答的能力，且具有更强的抑制小鼠肿瘤生长的能力。
【附图说明】
[0011]图1为本发明的亚细胞结构疫苗与已有的疫苗抑制肿瘤生长的对比图；
图2为本发明的亚细胞结构疫苗与已有的疫苗诱导T细胞应答的能力的对比图。
【具体实施方式】
[0012]实施例1一种亚细胞结构疫苗的制备方法，包括如下步骤:
步骤I，将经培养后的肿瘤细胞在含有氯化铵及硼替佐米的培养基中继续培养24-48小时，诱导自噬小体的形成;24-48小时后，收集全部的细胞培养物，4°C下先经1500rpm离心10分钟，去除大颗粒细胞杂质，收集离心上清;再将收集的上清经12000rpm离心15分钟;得到的沉淀经缓冲液洗涤，再次经12000rpm离心15分钟;收集沉淀并悬浮在缓冲液中，电镜下观察其结构为100-900nm的小泡结构，即为自噬小体疫苗；
步骤2，将自噬小体疫苗中的蛋白终浓度调整为lmg/ml，与浓度为lmg/ml化学合成的HSP704Q?-426肽段混合，缓慢加入戊二醛，持续搅拌下，在4°C中反应3-4小时；12000rpm离心15分钟去除上清中多余的戊二醛，得到的沉淀就是经过HSP70407-426修饰后的亚细胞结构疫苗;疫苗重悬在冻存保护液中，分装后冻存于_80°C冰箱或液氮中备用。
[0013]应用实施例1以小鼠Lewis肺癌为模型，验证实施例1所制备的亚细胞结构疫苗在小鼠肺癌治疗中的作用
首先建立小鼠肺癌模型，将0.5-1 X 16个小鼠Lewis肺癌细胞皮下接种于小鼠左前肢附近腋下，待肿瘤生长I周后，基本可以触到约绿豆大小的皮下移植瘤。
[0014]建模成功后，每组5只，随机将小鼠分为空白对照组，HSP7040?-426组，自噬小体疫苗组(实施例1中步骤I所制备的自噬小体疫苗)，经HSP704Q7-426+修饰后自噬小体疫苗组(实施例I所制备的亚细胞结构疫苗)以及肿瘤全细胞疫苗组，不同组的小鼠分别在腹股沟淋巴结注射蛋白量为20yg的疫苗，此后，每2天在相同时间用游标卡尺测量肿瘤细胞大小，观察肿瘤细胞的生长情况，结果如图1所示，经HSP70407-426修饰的自噬小体疫苗能更好的抑制小鼠肺癌生长。
[0015]待免疫2-3周后，处死小鼠，取出小鼠脾脏，制成单细胞悬液，以自噬小体疫苗为抗原刺激脾细胞后，ELISA检测脾细胞培养上清中小鼠T细胞表达IFN- γ的水平，结果如图2所示，HSP70407-426修饰的自噬小体疫苗有更强的诱导免疫应答的能力。
【主权项】
1.一种亚细胞结构疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤I，将经培养后的肿瘤细胞在含有氯化铵及硼替佐米的培养基中继续培养24-48小时，诱导自噬小体的形成;24-48小时后，收集全部的细胞培养物，4°C下先经1500rpm离心10分钟，去除大颗粒细胞杂质，收集离心上清;再将收集的上清经12000rpm离心15分钟;得到的沉淀经缓冲液洗涤，再次经12000rpm离心15分钟，收集沉淀并悬浮在缓冲液中；电镜下观察其结构为100-900nm的小泡结构，即为自噬小体疫苗； 步骤2，将自噬小体疫苗中的蛋白终浓度调整为lmg/ml，与浓度为lmg/ml化学合成的HSP704Q?-426肽段混合，缓慢加入戊二醛，持续搅拌下，在4°C中反应3-4小时；12000rpm离心15分钟去除上清中多余的戊二醛，得到的沉淀即为亚细胞结构疫苗;疫苗重悬在冻存保护液中，分装后冻存于-80°C冰箱或液氮中备用。2.一种如权利要求1所述方法制备的亚细胞结构疫苗。
【专利摘要】本发明公开了一种亚细胞结构疫苗及其制备方法<b>，</b>本发明的亚细胞结构疫苗是基于以硼替佐米及氯化铵诱导肿瘤细胞内短寿蛋白和缺损的核糖体产物作为抗原蛋白，通过自噬途径进入双层膜结构的自噬小体中，收集这样包裹肿瘤抗原的自噬小体，再经HSP70免疫激活肽段修饰，修饰后的自噬小体即为本发明的亚细胞结构疫苗，将疫苗经淋巴结给药可以有效诱发机体免疫系统的交叉递呈，激活CD4+、CD8+？T淋巴细胞及CTL细胞，达到更好的肿瘤杀伤的作用。
【IPC分类】A61K47/48, A61K39/00, A61P35/00
【公开号】CN105641712
【申请号】
【发明人】邢芸, 曹荣月, 胡红明, 周镇先
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月29日