Wp1066在制备抑制喉癌肿瘤细胞生长药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小分子抑制剂WP1066的用途。
【背景技术】
[0002] 喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，在呼吸道肿瘤中发病率居第二位。 随着工业化的发展和空气污染的加重，喉癌在我国以及世界范围内其发病率呈逐步上升趋 势。有调查表明，喉癌的发病率不断升高，每年约增加25%。根据最新的研究，虽然近30年 来新的外科手术方法、化疗药物、更先进的放射治疗手段以及靶向药物已应用在喉癌的治 疗中，喉癌患者的总生存率并未得到提高，仅约50%，晚期喉癌的生存率更低达30~40%。 总体治疗效果仍难令人满意。
[0003] 目前研究阶段的基因治疗方法多为导入基因的方法（反义寡核苷酸法，慢病毒抑 制载体法等），涉及医学伦理问题，较难应用于临床。
[0004] WP1066分子结构如式I所示：
[0005]
[0006] 分子式：C17H14BrN30,分子量：356. 2 ;
[0007] 目前，尚未有WP1066抑制HOTAIR表达的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供WP1066在制备抑制喉癌肿瘤细胞生 长药物的应用。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] WP1066在制备抑制喉癌肿瘤细胞生长药物的应用。
[0011] 本发明的优点：
[0012] 实验证明WP1066对HOTAIR表达的抑制，从而抑制喉癌肿瘤细胞的生长，说明了 WP1066能抑制喉癌肿瘤细胞生长。实验证明WP1066对HOTAIR高表达的喉癌肿瘤细胞生长 抑制效果明显。
【附图说明】
[0013] 图1为实时定量PCR检测WP1066处理后喉癌细胞HOTAIR表达水平。
[0014] 图2为感染HOTAIR病毒后的H印2/H0TAIR细胞与H印2细胞HOTAIR表达水平的 差异。
[0015] 图3为WP1066处理后喉癌肿瘤细胞〇fep2与Hep2/H0TAIR)生长状况对比，其中 A为H印2/H0TAIR喉癌肿瘤细胞，B为H印2喉癌肿瘤细胞。WP1066对H印2喉癌细胞生长 的抑制效果更佳，且差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0016] 图4裸鼠荷喉癌细胞〇fep2与H印2/H0TAIR)各组处理后的瘤组织大体形态。
[0017] 图5裸鼠荷喉癌细胞〇fep2与Hep2/H0TAIR)处理后瘤组织生长曲线对比，其中A 为裸鼠荷H印2/H0TAIR喉癌肿瘤细胞组织生长曲线，B为裸鼠荷H印2喉癌肿瘤细胞组织生 长曲线。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0019] 实施例1
[0020] 我们通过收集喉癌术后标本，对比肿瘤及癌旁组织HOTAIR的表达，发现：喉癌中 HOTAIR表达显著高于癌旁组织，且化疗（顺铂+多西他赛）耐药患者肿瘤组织中的HOTAIR 表达高于对化疗敏感者。表明=HOTAIR高表达多预示化疗耐药，化疗效果差。
[0021] H0TAIR(GI :145688388)是长度为2158bp但不编码蛋白质的RNA分子，在染色体 12ql3区域，位于H0XC12和HOXCll编码区之间。
[0022] 选取人喉癌细胞H印2 (购自中国医学科学院基础医学研究所）作为实验细胞，将 H印2转染慢病毒（约每IO5个细胞感染10 9滴度的HOTAIR病毒3ul)，细胞培养箱内培养 24h，该细胞称为H印2/H0TAIR。使用实施例2中方法检测转染细胞HOTAIR表达水平，结果 如图2所示，可见H印2/H0TAIR细胞中的HOTAIR表达水平明显低于H印2细胞，差异有统计 学意义。
[0023] MTT法测定喉癌细胞株WP1066的半数抑制浓度
[0024] (1)按每孔IO4个将对数生长期的喉癌细胞接种于含IOOul完全培养基（含10% 胎牛血清的MEM/EBSS(MIN頂UM ESSENTIAL MEDIUM/Earle's Banlanced Salt Solution，含 平衡盐溶液含2. OOmM L-谷氨酰胺基本培养基））的96孔板中，再加入溶于DMSO的WP1066 试剂，使浓度分别为〇、〇. 5、1、2、4、8、16 μ mol/L)，每种浓度重复6次；对照组（只加相应完 全培养基）；
[0025] (2)培养24h后加入20 μ I (5g/L)MTT (Sigma，美国），继续培养4h，每孔加 200 μ 1DMS0,用紫外分光光度计570nm波长测定各孔的吸光度（A值），取每组6孔的均值； 各WP1066浓度组的A值/WP1066浓度为0组的A值即为细胞该浓度下WP1066对喉癌细胞 的抑制率。
[0026] (3)根据结果制作生长曲线，使用寇氏改良法计算IC5。：
[0027] 计算公式：IgIC50= Xm-I [P-(3-Pm-Pn)/4]
[0028] Xm :lg最大剂量；I :lg(最大剂量/相邻剂量）；P :阳性反应率之和；Pm :最大阳性 反应率；Pn :最小阳性反应率。
[0029] 经计算，喉癌细胞 H印2 的 IC5。为 4. 25 ymol/L，H印2/H0TAIR 的 IC5。为 2. 79 μπιο?/ L。喉癌细胞H印2, Hep/HOTAIR为将HOTAIR的干扰RNA病毒（序列见表1)稳定转染H印2 细胞，HOTAIR表达水平显著下降，建立HOTAIR低表达的舌癌细胞亚株-!fep2/H0TAIR。
[0030] 表 1H0TAIR 干扰 RNA 病毒
[0032] 实施例2
[0033] 实时定量PCR检测WP1066处理后喉癌细胞HOTAIR表达水平。
[0034] I ·细胞总RNA提取：
[0035] (1)培养喉癌肿瘤细胞（5X IO7)，预冷的PBS洗两次，加入Trizol Iml，反复吹打 至贴壁细胞完全脱落，收集细胞到I. 5mL EP管中；
[0036] (2)冰浴裂解 30min ;
[0037] (3)加氯仿0· 2mL，用力振摇5min，冰浴3min待水相有机相分离；4°C，12000g，离 心 20min ;
[0038] ⑷小心吸取上层水相入新EP管，加入等体积异丙醇，充分混勾，冰浴IOmin ;4°C， 12000g，离心 20min ;
[0039] (5)倾去上清，加DEPC(焦碳酸二乙酯）水稀释的75%乙醇洗涤，共三次；4°C， 1000g，离心 IOmin ;
[0040] (6)倾去上清，置于冰中开盖在超净台上凉5~IOmin ;
[0041] (7)以50 μ L左右的DEPC 7K，充分溶解RNA。
[0042] (8)吸取1 μ L RNA样品，用Nanodrop仪测定其浓度。
[0043] II .反转录
[0044] 表2反转录试剂配比
[0046] 轻轻摇匀-----室温 IOmin-----42°C 60min-----(TC 5min，_80°C保存备用。
[0047] III.实时定量 PCR :
[0048] 按照 mirTakara? qRT-PCR miRNA 检测试剂盒进行。
[0049] IV · Real time PCR 过程
[0050] 表3Real time PCR试剂配比及程序
[0051]
[0052] Real time PCR 过程使用 MJ-real time PCR 仪（BioRad 公司，美国）完成，使用 U6作为内参。Opticon 3软件计算Δ C(t)值（2~_Δ Δ CT的计算方法）表示。Δ Δ Ct的具 体计算方法如下：
[0053] Δ Δ Ct= WP1066及阴性对照组HOTAIR的C τ值/对应U6的C τ值-空白对照组 HOTAIR的Ct值/对应U6的C τ值。
[0054] 经计算：
[0055] (1)如图1中所示：Real time PCR检测WP1066处理后喉癌细胞〇fep2)HOTAIR表 达水平：WP1066处理组细胞的HOTAIR的表达明显减弱。表明：WP1066能抑制HOTAIR的表 达。
[0056] (2)如图2中所示：!fep2/H0TAIR细胞中HOTAIR表达水平与H印2细胞相比，HOTAIR 表达水平显著受到抑制，建立的HOTAIR低表达的舌癌细胞亚株〇fep2/HOTAIR)可用于实 验。
[0057] 实施例3
[0058] 1.处于对数生长期的细胞常规消化，接种于96孔板，接种量2000个（200 μ 1)/ 孔；
[0059] 2.接种12小时后，常规WP1066处理。
[0060] 3.分别于处理后0、24、48、72、96行MTT检测：加入20 μ I (5g/L)MTT于待测的96 孔板内，37°C培养4小时，小心弃上清液，每孔加DMSO 200 μ 1并振荡15min已完全溶解结 晶，最后用紫外分光光度计570nm波长测定各孔的吸光度（A值），取每组3孔的均值。
[0061] 4.肿瘤细胞存活率计算方法：用未处理的细胞作为对照，求出试验组肿瘤细胞存
活率。
[0062]
[0063] 经计算：
[0064] 如图3所示：WP1066处理后喉癌肿瘤细胞〇fep2与!fep2/H0TAIR)存活率对比： WP1066对喉癌细胞生长具有明显抑制作用，且对H印2抑制效果更佳。
[0065] 实施例4
[0066] 1.将H印2与!fep2/H0TAIR接种于裸鼠皮下（约IO7个细胞/只），并随机分为空 白对照组、阴性对照组及WP1066处理组，7天后开始治疗，从第一次治疗开始，隔2天进行一 次治疗，总共进行7次治疗。
[0067] 2.治疗方法为瘤内注射。空白对照组，不作任何处理；阴性对照组，每只裸鼠每次 注射20ulDMS0 ;WP1066处理组：每只裸鼠每次注射WP1066 (浓度为50uM) 20ul。
[0068] 3.每次治疗前测量裸鼠瘤组织长、短径：a、b，并计算体积V = ab2/2,绘出肿瘤生 长曲线。
[0069] 经计算：
[0070] 如图4及图5所示：将H印2与！fep2/H0TAIR接种于裸鼠皮下1周后，WP1066治 疗7次后，观察治疗效果：① WP1066能明显抑制裸鼠荷喉癌细胞模型肿瘤组织的生长； ②WP1066对裸鼠荷喉癌细胞H印2模型组肿瘤组织生长的抑制作用明显强于裸鼠荷喉癌细 胞H印2/H0TAIR模型组，这表明WP1066对HOTAIR高表达组织生长的抑制效果更佳。
【主权项】
1. WP1066在制备抑制喉癌肿瘤细胞生长药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了WP1066在制备抑制喉癌肿瘤细胞生长药物的应用。实验证明WP1066对HOTAIR表达的抑制,从而抑制喉癌肿瘤细胞的生长，说明了WP1066能抑制喉癌肿瘤细胞生长。WP1066对HOTAIR高表达的喉癌肿瘤细胞生长抑制效果明显。
【IPC分类】A61K31/44, A61P35/00
【公开号】CN105640953
【申请号】
【发明人】张仑, 刘爱芹, 周旋
【申请人】天津市肿瘤医院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月2日