一种多价ezh2肿瘤相关抗原肽及其制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域。具体而言，本发明涉及多价EZH2肿瘤相关抗原肽。本发明 还涉及编码所述抗原肽的分离的核酸，包含所述核酸的构建体和载体，以及包含所述核酸 的宿主细胞。本发明还涉及所述抗原肽的制备方法和其在制备药物组合物或疫苗中的用 途。
【背景技术】
[0002] EZH2是多梳蛋白家族的重要成员，它与其它3个亚基(EED、SUZ12和RbAp46/48) - 道共同组成多梳蛋白抑制性复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)。作为PRC2 的核心亚基，EZH2具有组蛋白甲基转移酶活性，在维持细胞增殖、干细胞自我更新和调节细 胞周期中发挥重要作用，并通过与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和DNA甲基转移酶(DWTs)协 同作用使抑癌基因表达沉默，由此促进肿瘤发生以及侵袭转移。人EZH2基因由20个外显子 和19个内含子构成，编码由746个氨基酸残基构成的蛋白分子(Margueron R等人，Nature， 469(7330) :343-349(2011) ;Vire E等人，Nature,439(7078) :871-874(2006))。近年来研究 发现，EZH2是一种肿瘤相关抗原，能作为肿瘤标志物在不同的肿瘤组织中高表达，且其表达 水平与肿瘤的恶性程度高度正相关，由此EZH2正在成为抗肿瘤免疫治疗的新靶点 (Benetatos L等人，Cell Mol Life Sci，71(2):257-269(2014);Chang CJ等人，Br J Cancer，106(2):243-247(2012);Crea F等人，Crit Rev Oncol Hematol,83(2):184-193 (2012) ;Wan L等人，Clin Transl Oncol ,15(2) :132-138(2013) ;Goe BP等人，Plos One,8 (8):e71670(2013) ;Hajosi-Kalcakosz S等人，Diagn pathol ,7:86(2012))。已经在EZH2蛋 白一级结构中鉴定出多个可作为肿瘤相关抗原的肽段，包括4&120-128 4&165-1744&243-245，Aa291-299，Aa666-674，Aa699-708，Aa735-742等。重要的是这些肿瘤相关抗原肽在体 内能诱导产生抗肿瘤抗体并激活特异性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提示EZH2在抗 肿瘤免疫治疗中的重要应用价值(Ogata R等人，Prostate,60(4) :273-281(2004) ;Steele JC等人，Bri J Cancer，95(9):1202-1211(2006);Komohara Y等人，J Urol ,177(3) :1157-1162(2007);Itoh Y等人，Oncol R印，18(5):1231-1237(2007))〇
[0003] 由于短肽(如氨基酸序列长度在30aa以下）的原核表达通常存在表达量低，纯化困 难，免疫原性差等问题，为了获得高纯度EZH2肿瘤相关抗原肽，本发明选取4条已经鉴定的 EZH2 肿瘤相关抗原肽(Aal20-128，Aal65-174，Aa291-299，Aa735-742)，利用基因重组技术 在原核表达系统中人工设计与合成了含有上述4种EZH2肿瘤抗原肽的小分子融合蛋白（称 之为多价EZH2肿瘤相关抗原肽），其保留了 EZH2的抗原特征，能在动物体内诱导特异性抗体 生成。
【发明内容】
[0004] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、生物化学、 免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发 明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0005] 根据本发明，术语"免疫原性（immunogenicity)"是指，能够刺激机体形成特异抗 体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分 化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫 系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种 抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素:抗原的性质、宿主的反应性 和免疫方式。
[0006] 根据本发明，术语"免疫原性片段"是指这样的多肽片段，其至少部分地保留了所 源自的蛋白的免疫原性。
[0007] 根据本发明，4条EZH2肿瘤相关抗原肽为Aal20-128，Aal65-174，Aa291-299和 △ &735-742<^&120-128的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其对应的编码核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示;Aal65-174的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，其对应的编码核苷酸序列如 SEQIDN0.4所示;Aa291-299的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，其对应的编码核苷酸序列 如SEQIDN0.6所示 ;Aa735-742的氨基酸序列如SEQIDN0.7所示，其对应的编码核苷酸序 列如SEQ ID N0.8所示。
[0008] 在本发明中，术语"多肽"和"蛋白质"具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明 中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表 不。
[0009] 根据本发明，术语"大肠杆菌表达系统"是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达 系统，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于:GI698，ER2566， BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)〇
[0010] 根据本发明，术语"载体(vector)"是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运 载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以 通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。 载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于:质粒;噬菌体;柯斯质粒等等。
[0011]根据本发明，术语"药学可接受的载体和/或赋形剂"是指在药理学和/或生理学上 与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences . Edited by Gennaro AR,19th ed. Pennsylvania:Mack Publ ishing Company，1995)，并且包括但不限于:pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增 强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液;表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离 子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0012] 根据本发明，术语"佐剂"是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送 入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不 限于铝佐剂(例如氢氧化铝）、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂）、短小棒状 杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在 临床实验中使用较多。
[0013] 将两种或更多种蛋白融合表达以形成融合蛋白的技术是本领域公知的（参见例 如，J . Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及 F.Μ. Ausube 1等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995)。通常， 通过使用重组DNA技术将编码两种或更多种蛋白的DNA片段符合读框地连接在一起，并进行 蛋白质表达来获得融合蛋白。任选地，可使用或不使用接头来将两种或更多种蛋白融合表 达。
[0014] 根据本发明，术语"接头"是指用于连接两个分子(例如蛋白）的短肽。通常，通过将 编码该短肽的多核苷酸序列引入(例如，通过PCR扩增或连接酶)分别编码所要连接的两种 目的蛋白的两个DNA片段之间，并进行蛋白质表达来获得融合蛋白，例如目的蛋白1-接头_ 目的蛋白2。如本领域技术人员公知的，接头包括但不限于柔性连接肽，例如61 7-617-617-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 等等。
[0015] 根据本发明，术语"有效量"是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如， 预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤）的发生的量;治 疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。 测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量 将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如 年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
[0016] 本发明至少部分基于发明人如下