一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及发酵工程领域，特别涉及利用基因工程技术对谷氨酸棒杆 菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032进行分子改造，获得产谷氨酸的温敏型重组 菌。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。在食品、 医药与工业方面有广泛的用途。为了提高谷氨酸产率，谷氨酸生产菌的研究工作中最为突 出的是高产谷氨酸菌的选育工作。从自然界分离得到的谷氨酸生产菌野生株，在生产性能 方面往往不能满足发酵生产发展的要求。谷氨酸生产菌株具有较大的自然变异能力，通常 负变异频率高于正变异频率，结果造成菌种的衰老和菌株活力减退，导致国内谷氨酸生产 行业普遍存在着产酸率水平低、糖酸转化率低、成本高、能耗高等瓶颈问题，因此优良生产 菌种的选育，一直是谷氨酸发酵工业上的主要研究课题之一。
[0003]目前在我国谷氨酸工业生产中，大部分企业使用的菌株为谷氨酸温度敏感突变 株，该菌株具有温度敏感的特性，在菌体进入指数生长期时提高培养温度，强制细胞由正常 细胞转型为细胞壁合成缺陷的细胞，促进谷氨酸的分泌，从而达到大量合成并积累谷氨酸 的目的。该工艺的特点是：（1)具有耐生物素、温度敏感的特点，要在较高的温度下才能正常 发酵产酸(一般为37°C -40°〇。（11)温度转换是影响产酸的关键，温度对谷氨酸发酵具有 生产性的影响表明，温度转换后，必须进行适度剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向积 累型细胞的转变，以保证在富含生物素的培养基中高产谷氨酸。0Π )生产原料易得，不仅可 以利用生物素含量高的原料如糖蜜、薯干等直接进行发酵生产，而且可以利用淀粉质原料。 (IV)发酵工艺趋于简单发酵过程容易控制、谷氨酸产量高、发酵周期短、产酸稳定以及节约 能耗，降低成本等。
[0004] 早在20世纪70年代，日本就有温度敏感型谷氨酸菌的研究报道。国内最早的报道 是1985年上海市工业微生物所的孙智凤等对温度敏感型变异株Do菌的选育及其作用的报 道，他们以该菌为出发菌株，经DES和NTG连续诱变处理，选育得到一株优良的温度敏感型NI 菌，此菌的生物素适应范围更广（25yg/l - 200yg/l)，同时要在较高温度(37°C - 40°C)下才 能正常发酵产酸。将NI菌用于大米水解糖在6.5m3发酵罐上生产谷氨酸，平均产酸率达 5.89%，平均糖酸转化率为47.25%，平均发酵周期为26.5h。2002年陈宁等报道称定向选育 出了具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟盐抗性的温度敏感性突变株TMG0106,然后，以该突变株 和产酸率高的天津短杆菌TG961为亲株，通过原生质体融合技术，成功地选育出了产酸率高 的融合子CN1021，在6m 3发酵罐上其谷氨酸产量达14.6 %，糖酸转化率达62.8 %，并且该菌 株系温度敏感型菌株，可用于谷氨酸强制发酵。
[0005] 由此可见，对于温度敏感型谷氨酸菌株的选育，我国还处于由传统的选育技术(主 要是将野生株谷氨酸生产菌进行有目的的定向改造，或采用紫外线等物理诱变因子或亚硝 基胍等化学诱变因子进行常规的诱变育种）向DNA重组技术的转变过程，采用基因工程技术 进行温敏型谷氨酸菌株的改造还有待进一步与深入。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌，是通过改造野 生型谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ATCC 13032)，敲除其基因组中肽聚糖合成途径中的两 个关键基因 UDP-N-烯醇式乙酰葡萄糖胺转移酶基因(murA)和UDP-N-乙酰胞壁酸脱氢酶基 因(murB)，获得温敏型重组菌，重组菌的谷氨酸产量得到明显提升。
[0007] 本发明还提供一种利用重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸的方法，具体包括如 下步骤：
[0008] (1)将菌体接种到斜面培养基中活化，32 °C培养24-36h;
[0009] (2)将活化好的菌种接入种子培养基中，32°C，200rpm，培养6-8h;
[0010] (3)将培养好的种子按10%接种量接入发酵培养基中，32°C，200rpm发酵培养；
[0011] (4)待发酵培养至菌体0D6Q()= 12-16时，将发酵温度提高至38 · 5°C，200rpm培养至 总发酵28-32h。
[0012] 所述斜面培养基的组成：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，牛肉膏l%，NaCl 0.25%， 1%504 0.05%，腿2卩〇4〇.1%，玉米浆2%，琼脂2%。
[0013]所述种子培养基的组成：葡萄糖30g/L，K2HP〇4 · 3H20 0.2g/L，MgS〇4 · 7H20 0.8g/ L，MnS〇4 2mg/L，FeS〇4 2mg/L，VB1 0.3mg/L，VH 0.2mg/L，酵母粉 10g/L，蛋白胨
[0014] 5g/L，尿素 0.5g/L，Metlg/L。
[0015] 所述发酵培养基的组成：葡萄糖8g/L，K2HP〇4 · 3H20 0.4g/L，VH 0.35mg/L，VB1
[0016] 0.5mg/L，甜菜碱5g/L，MnS〇4 30mg/L，FeS〇4 30mg/L，MgS〇4 · 7H20 2g/L，酵母粉 15g/L，蛋白胨5g/L。
[0017]本发明通过基因重组的方法失活谷氨酸棒杆菌野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032的肽聚糖合成途径中的两个基因 murA和murB，干扰该菌株细胞壁的正常合成，导致菌 株出现温度敏感的性状，有利于增强部分胞内代谢产物向胞外的转运作用，促进如谷氨酸 等代谢物的合成。利用本发明提供的方法，对其他谷氨酸棒杆菌进行改造，可以使更多菌株 获得温度敏感性状。在实际应用中，提高培养温度能够使得温敏型重组菌的细胞壁结构发 生变化，从细胞形态上表现为细胞变圆、变大，这些细胞的细胞壁通透性增强，利于胞内产 物分泌到培养基中，解除胞内的反馈阻遏和抑制，从而促进目的产物的合成。
【附图说明】
[0018] 图 1:原始菌ATCC 13032和重组菌C.glutamicum ATCC 13032AmurAAmurB的生长 曲线。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合具体实施例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更 为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中涉及的方法、成分 及用量，如无特殊说明，均为本领域技术人员所知常规方法。
[0020] 本发明的研究基础，是对现有的通过诱变筛选得到的谷氨酸温度敏感突变株进行 全基因组的测序，通过比较基因组学研究发现该菌株缺失了murA和murB这两个基因，并且 通过敲除-回补实验对这两个基因的功能进行验证，证实了这两个基因的存在与否决定了 菌株是否具有温度敏感特性；
[0021] 对现有的通过诱变筛选得到的谷氨酸温度敏感突变株C.glutamicum CN 1021进 行全基因组测序，通过比较基因组学研究发现，该菌株缺失了 murA和murB两个肽聚糖合成 途径上的关键基因。
[0022] 通过PCR的方法，从谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032中克隆得到murA和 murB两个基因。通过酶切连接的方法将两个基因片段连接至过表达载体pXMJ19上，构建过 表达质粒。然后通过化学转化和电转化的方法，将过表达质粒导入到目的宿主即 C·