拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，具体涉及具有抑制基质金属蛋白 酶，具有减轻骨质疏松症的多肽。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松即骨质疏松症(osteoporosis)，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有 正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。 在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特 征。
[0003] 目前，用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为抑制骨吸收 药，包括钙剂、维生素 D及活性维生素 D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮;第二类为促 进骨性成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。这些药物可以阻止骨吸 收但对骨形成的作用特别小。
[0004] 基质金属蛋白酶家族参与多种正常的生理功能，例如卵细胞着床，骨骼生长和器 官发育等。基质金属蛋白酶被更多的看作是这些病理过程的调节因子。其家族成员包括 MMP1-26分布于骨基质中。大量研究表明基质金属蛋白酶参与骨的重塑和构建且表达骨吸 收活性，其中MMP-2、MMP_9等对原发性骨质疏松发病的影响已被证实。目前研究发现，MMP-2 是分布最广的MMP，其主要作用可能为降解损伤或变性胶原以保护机体。MMP-9也是明胶酶 中的一种。MMP-9包含一个V型的胶原蛋白结构域，这个结构域有高度的糖基化作用，，它影 响底物的特异性以及有抗衰变的作用。MMP-9有许多作用底物，如1￥、￥、\1、叉、见型胶原、 蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也 是MMP-9作用的底物。在骨代谢中，首先由丽P-2启动骨转换，随后激活MMP-9，在丽P-2及 MMP-9的作用下水解部分降解的I型胶原及其他多种骨基质蛋白，骨盐因失去依附而丢失， 发生骨质疏松。因此，测定MMP-2和MMP-9活性是影响骨质疏松的重要指标。抑制基质金属蛋 白酶，可以有效抑制骨质疏松。组织金属蛋白酶抑制因子-1 (t i ssue inhibi tor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)是由成骨细胞分泌的内源性基质金属蛋白酶抑制剂。研 究表明，TIMP-1能特异性的抑制基质金属蛋，在骨重建过程中对启动骨吸收与骨形成起着 重要作用。因此，制备拟??ΜΡ-1多肽，可以有效抑制MMP，从而抑制骨质疏松。这一发现为骨 质疏松患者的治疗找到了新的突破口。尽管如此，并没有成熟开发的拟TIMP-1多肽问世，用 于治疗骨质疏松症。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 本发明提供全新的序列，该序列为拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，对骨质疏松 症具有很好的疗效。
[0007] 技术方案
[0008] 拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于其序列为 PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA，其多肽在治疗骨质疏松症的应用。
[0009] 有益效果
[0010] 拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制基质金属蛋 白酶2、9的酶活力。在体试验研究表明，我们设计的多肽可以缓解骨质疏松模型动物的骨密 度下降。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1
[0012] 多肽的化学合成方法
[0013]多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质（可在Advanced ChemTech公司购得)上有自由氨基，按C端向N端的顺序将各个氨基酸连接。每一步连接过程 中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，H0Bt，DIEA和 Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑的混合物来封 闭未连接的自由氨基。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上 的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺。最后，当所有氨基酸残基 顺序连接之后，多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来。
[0014] 应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA，该序列 为全新序列。
[0015] 也可委托上海吉尔合成。
[0016] 实施例2
[0017]多肽体外对基质金属蛋白酶2、9的IC50值。
[0018] 重组人基质金属蛋白酶-2由E.coli细胞表达.该酶用Ο.ΟΙμΜ的基质金属蛋白酶-3 活性位点活化，所用的缓冲液为l〇〇mM Tris/HCl，pH 7.4，100mM NaCl，10mM CaCl2and 0.01%TWeen-20。活化时基质金属蛋白酶-2的浓度为72ng/yl(lyM)。酶活力的检测是通过 切割荧光产生多肽底物Mca-Pr〇-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH 2并检测产生的荧光值实现 的（激发波长= 328nm，检测波长= 392nm)。所有的检测在37°C下100μ1反应体系中进行。实 施例1测得的IC50值为75.07ymol。
[0019] 重组人基质金属蛋白酶-9的检测与-2的检测类似并使用同样的荧光产生底物。反 应也是在37°C下100μ1反应体系中进行。检测时向反应体系中加20μ1重组人基质金属蛋白 酶-9(2ngAU).底物的终浓度为10μΜ。实施例1测得的IC50值为25.80μπι 〇1。
[0020] 实施例3
[0021]多肽对体外培养人成骨细胞的生长EC50。
[0022]采用ΜΤΤ比色法。将对数生长的人成骨细胞，以1.0Χ105加入96孔培养板中，培养 24h，实验孔、分别加入不同浓度的实验药物实施例1多肽(上海吉尔合成）；空白组加入相同 体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMS0，孵育30min， 在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成骨细胞增殖率=(1 一实验组吸光值/对照组吸 光值）X 100%。计算出实施例1多肽的EC50为13.15μΜ。
[0023] 实施例4
[0024]实施例1多肽对骨密度的影响：取50只大鼠随机分为5组:高剂量组、中剂量组、低 剂量组，阳性对照组，模型组，每组10只。造模及治疗大鼠用10%的水合氯醛以3ml/100g行 腹腔注射，麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于事先制作的老鼠手术台上，于腹股沟正中处做 纵切口，长约2cm，切开皮肤及皮下筋膜，水平切断左侧股神经，靠近上段予以切除5mm，并作 神经断端打结，缝合切口。再将大鼠取俯卧位固定于手术台上，在股骨大转子与靠近尾部之 间与后外方45°方向行长约lcm的切口，暴露坐骨神经，靠近近端予以切除5mm，并作神经断 端打结，缝合切口，普通喂养13周后给药。治疗:模型组按照lml/100g的剂量灌胃生理盐水； 阳性对照组灌胃2.0ml二磷酸盐;高中低剂量组分别给予实施例1多肽0.5，1.0，2mg/Kg灌 胃，连续给药10周。先采用双能X线骨密度仪测双侧股骨骨密度。
[0025]结果:如表1。与模型组大鼠相比，实施例1多肽低、中、高剂量能显著性缓解大鼠骨 密度下降(P〈〇.〇5)。
[0026] 表1实施例1多肽对大鼠骨密度的作用
[0027]
[0028] *p〈〇 · 05，#p〈0 · 01 与模型组相比 [0029] 实施例5
[0030]实施例1多肽对骨密度的影响：取50只大鼠随机分为5组:高剂量组、中剂量组、低 剂量组，阳性对照组，模型组，每组10只。造模及治疗大鼠用大鼠维甲酸70mg/kg灌胃两周。 治疗:模型组按照Iml/lOOg的剂量灌胃生理盐水；阳性对照组灌胃2.0ml二磷酸盐;高中低 剂量组分别给予实施例1多肽〇. 5，1.0，2mg/Kg灌胃，连续给药10周。先采用双能X线骨密度 仪测双侧股骨骨密度。
[0031 ]结果:如表2。与模型组大鼠相比，实施例1多肽低、中、高剂量能显著性缓解大鼠骨 密度下降(P〈〇.〇5)。
[0032]表2实施例1多肽对大鼠骨密度的作用
[0033]
[0034] *p〈〇 · 05，#p〈0 · 01 与模型组相比。
【主权项】
1. 拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于其序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA。2. 根据权利要求书1所述的拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽在治疗骨质疏松症的应 用。
【专利摘要】本发明涉及药物领域，具体涉及拟组织金属蛋白酶抑制因子多肽及其应用，可以抑制基质金属蛋白酶2、9，具有减轻骨质疏松的多肽。其序列为PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA是全新的序列，它们可以在体外抑制基质金属蛋白酶2、9的活力，并在体内试验中可以缓解骨质疏松模型动物的骨密度下降，具有潜在的新药开发价值。
【IPC分类】A61K38/16, A61P19/10, C07K14/00
【公开号】CN105601719
【申请号】CN201610066339
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月30日