一种异佛尔酮类荧光探针及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种荧光探针，具体涉及一种异佛尔酮类荧光探针及其制备与应用， 属于有机发光材料领域。
【背景技术】
[0002] 硫化氢(H2S)-直以来都被认为只是一种有臭鸡蛋气味的有毒气体，但近年来发 现，它是继一氧化碳和一氧化氮之后，可在生命体内发挥生理作用的第三种气体信号分子， 作为一种气体递质，它不需借助任何特殊的载体就可以快速、自由的通过细胞膜，对一系列 生物靶点产生影响，参与机体多种功能的调节，如神经保护、细胞生成、促血管生成、抗氧化 应激等。
[0003] 20世纪90年代中期，人们发现机体可以内源性产生H2S气体，它在体内主要靠两种 途径产生，一种是以体内含硫的氨基酸如半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸等为底物，在 胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-0-synthase，CBS)、胱硫醚-γ -裂解酶（cystathionine-y-lyase，CSE)、半胱氨酸转移酶等催化作用下产生的；另一方法是非酶途径，主要在糖的 氧化中由硫元素到H 2S，这一途径的所有基本组成部分都存在体内，包括还原型硫的提供。
[0004] 目前，对硫化氢生理功能及作用机制的研究正在进一步进行中，因而，发展快速、 灵敏、简便的检测生物硫化氢的方法对硫化氢的功能研究具有巨大的推动作用。
[0005] 传统的检测H2S的方法包括分光光度法及电化学法，但这两种方法的检测误差较 大，而且只能测定血浆或组织匀浆中的出5,不能用于测定细胞甚至活体中的H 2S。相比之下， 荧光探针由于灵敏，快速，方法便捷，可以用于活体细胞检测，已经广泛应用于许多物质的 检测。因此，建立快速、准确、实时荧光检测硫化氢的方法已成为人们瞩目的焦点。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种异佛尔酮类荧光探针，能快速、灵敏、特异性检测 硫化氢。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供的异佛尔酮类荧光探针，结构如式I所示：
[0009] 该荧光探针的特征在于它本身在生理环境中有微弱荧光，与硫化氢特异性快速反 应，可生成具有强荧光的产物，从而实现对硫化氢的特异性检测。
[0010] 本发明的第二个目的是提供式I所示的荧光探针的制备方法，合成路线短，反应条 件简单。
[0011] 为实现上述目的，本发明的异佛尔酮类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)式II化合物的制备：惰性气体保护下，将异氟尔酮（3，5,5_三甲基-2-环己烯 酮）、丙二腈、吡啶加入反应瓶中，乙醇为溶剂，加热回流反应18~24h，反应结束后降至室 温，反应液采用硅胶柱层析提纯，洗脱剂为V石油醚:V乙酸乙酯=2~5:1，得到式II化合物； 其中，所述的异氟尔酮与丙二腈的摩尔比为1:1~1:4。
[0013] ⑵式III化合物的制备:惰性气体保护下，将式II化合物、对羟基苯甲醛及吡啶加 入反应瓶中，乙醇为溶剂，加热回流反应4~18h，反应结束后降至室温，浓缩，加去离子水抽 滤，保留红橙色滤饼，滤饼采用硅胶柱层析提纯，洗脱剂为V二氯甲烷:V乙酸乙酯=1~3:1， 得到式III化合物;其中，所述的式II化合物与对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1~1:4。
[0014] (3)式I化合物的制备：将式III化合物与2,4_二硝基氟苯、三乙胺加入反应瓶中， 二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈为溶剂，室温或加热至50~80°C搅拌反应8~36h，待反应结束 后，浓缩反应液得粘稠混合物，加去离子水洗涤3~5次，加入二氯甲烷萃取，分液留存二氯 甲烷层，加入无水硫酸钠干燥，浓缩，得到浅黄色固体粉末，粉末采用硅胶柱层析提纯，洗脱 剂为V石油醚:V二氯甲烷= 0.5~1:1，得到式I所示的荧光探针纯品；其中，所述的式III化 合物与2,4_二硝基氟苯的摩尔比为1:1~1:4。
[0015] 反应路线如下：
[0017] 本发明的第三个目的是提供式I所示的荧光探针在检测生物、环境、食品硫化氢中 的应用。
[0018] 为实现上述目的，本发明的异佛尔酮类荧光探针在检测生物硫化氢中的应用，可 通过以下步骤实现:在待检测体系中加入式I所示的荧光探针，配制其终浓度为5~20μΜ，37 °C下孵育lh，通过检测体系荧光强度实现检测目的；待检测体系为组织上清液或细胞匀浆 液，通过荧光分光光度计检测荧光强度，待检测体系为细胞培养基时，通过激光共聚焦显微 镜观察活细胞荧光成像。
[0019] 本发明的异佛尔酮类荧光探针在检测环境硫化氢中的应用，可通过以下步骤实 现:在待检测体系中加入式I所示的荧光探针，使其终浓度为5~20yM，37°C下孵育lh，通过 荧光分光光度计检测荧光强度;待检测体系为被污染土壤、被污染水体或大气污染尘埃。
[0020] 本发明的异佛尔酮类荧光探针在检测环境硫化氢中的应用，可通过以下步骤实 现:在待检测体系中加入式I所示的荧光探针，使其终浓度为5~20yM，37°C下孵育lh，通过 荧光分光光度计检测荧光强度;待检测体系为肉类匀浆液。
[0021] 本发明利用硫化氢的还原性或亲核性，设计了可与硫化氢特异性反应的荧光探 针，反应机理如图1所示。本发明的荧光探针本身有微弱的荧光，与硫化氢反应后可生成具 有强荧光的产物，因而可用于生物、环境、食品硫化氢的检测。由于小分子荧光探针具有体 积小、生物膜通透性良好的优点，因而荧光探针法除适用于检测环境、食品、组织匀浆中的 硫化氢，还适用于活细胞中硫化氢的检测。
[0022] 本发明具有以下有益效果：（1)稳定性好，能够长期保存使用；（2)具有长的荧光发 射波长(592nm)，能够有效避免来自生物大分子背景荧光的干扰；（3)具有优秀的选择性，不 受生命体中一些氨基酸等物质的干扰，能特异性地检测生物、环境、食品中的硫化氢；（4)具 有良好的生物膜通透性和低细胞毒性，适用于活细胞中硫化氢的检测；（5)本发明的荧光探 针合成路线短，反应条件温和，具有很大的实用价值。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明的荧光探针与硫化氢反应的机理示意图；
[0024] 图2是本发明的荧光探针的核磁共振氢谱图；
[0025] 图3是本发明的荧光探针的荧光强度和硫化氢浓度变化的关系图；
[0026] 图4是本发明的荧光探针对生命体中一些氨基酸等物质的响应情况；
[0027] 图5是本发明的荧光探针分子的浓度与细胞毒性的影响；
[0028] 图6是本发明的荧光探针分子在细胞培养24h后的细胞抑制率图；
[0029] 图7是本发明的荧光探针分子检测水溶液中硫化氢的荧光光谱；
[0030] 图8是本发明的荧光探针分子检测肉类食品中硫化氢的荧光光谱。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0032] 实施例1: 一种异佛尔酮类荧光探针的制备，包括以下步骤：
[0033] (1)式II化合物的制备：惰性气体保护下，将异氟尔酮（l.Ommol)、丙二腈（1.0~ 4.0mmol)、吡啶(0. lmmol~0.4mmol)加入反应瓶中，乙醇为溶剂，加热回流18~24h，反应结 束后降至室温，反应液采用硅胶柱层析提纯，洗脱剂为V石油醚:V乙酸乙酯=2~5:1，得到 式II化合物纯品；
[0034] (2)式III化合物的制备:惰性气体保护下，将式II化合物（1.0_〇 1)与对羟基苯甲 醛(1.0~4.0mmol)及P比啶(0.1~0.4mmol)加入反应瓶中，乙醇为溶剂，加热回流4~18h，反 应结束后降至室温，浓缩，加入去离子水抽滤保留红橙色滤饼，滤饼采用硅胶柱层析提纯， 洗脱剂为V二氯甲烷:V乙酸乙酯=1~3:1，得到式III化合物纯品；
[0035] (3)式1化合物的制备：将式111化合物（1.〇111111〇1)与2,4-二硝基氟苯（1.0~ 4.0mm〇l)、三乙胺（0.1~0.8mmol)加入反应瓶中，二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈为溶剂，室温 或加热至50~80°C搅拌反应8~36h，待反应结束后，浓缩反应液得粘稠混合物，加去离子水 洗涤3~5次，加