[0030] 第一部分：细胞样本的收集与处理：以人皮肤细胞（HSF)体外培养，给5种不同浓 度的双氧水处理为例
[0031] ⑴将HSF细胞铺于2个六孔板的10个孔之中，每孔数量控制在80000,每孔含Iml 的高糖DMEM培养基，含10%的胎牛血清，放置于C02培养箱37°C培养24h使其正常贴壁。
[0032] ⑵吸走原有培养基，用培养基配置5个不同浓度的双氧水，双氧水浓度为（单位 μ M)0、200、400、800、1000,每2个孔分别加入同一种浓度的双氧水处理。放置于C02培养 箱37°C培养24h使其正常贴壁。
[0033] ⑶弃去含双氧水的培养基，用PBS冲洗2遍，每遍1分钟，之后进入RNA提取步骤。
[0034] 第二部分：RNA提取步骤提取及相关PCR部分
[0035] 一、组织、细胞中总RNA的提取：
[0036] ⑴样品处理：
[0037] 贴壁细胞：取Iml裂解液加入六孔板内对细胞进行吹打。
[0038] 悬浮细胞：将5-10X IO6个细胞（6孔板中1个孔）溶于Iml裂解液中，进行吹打。
[0039] 组织块：均值样本40-100mg组织样本溶于Iml裂解液中，组织块需完全浸入。
[0040] ⑵将处理后的溶液转入I. 5ml离心管中，室温静置5分钟。
[0041] ⑶加0· 2ml氯仿，手摇15s，静置3分钟；4°C，12000g，15分钟。
[0042] ⑷吸取上层无色水相到新管中，加 0. 5ml异丙醇，静置10分钟，4°C，12000g，10分 钟，弃上清，加 lml，75%的乙醇。漩涡混合，离心：4°C，7500g，5分钟。
[0043] (5)室温干燥5-10分钟，用20-50ul的无 RNA酶的水溶解，可于一80°C保存。
[0044] 二、RT-PCR :
[0045] (I) Iul 的 oligo (dt)，（500ug/ml)，4ul 的 dNTP (2. 5mM)，lng_5ug (l_2ul)的总 RNA。 加水至13ul。
[0046] ⑵65°C孵育5分钟，迅速置冰上冷却1分钟。短暂离心加入：4ul的5*缓冲液， 2ul的0.1 M DTT，轻轻混匀。缓冲液含为Tris-HCl、KCl、MgClJ^常用缓冲液。
[0047] ⑶37°C，2分钟。加入Iul逆转录酶，轻轻混匀；37°C，40分钟，紧接着70°C，10分 钟，可于一20°C保存。
[0048] 三、qPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统）：
[0049] ⑴荧光PCR反应体系如下所示：
[0050] CN 105177123 A 说明书 4/5 页
[0051] 正向引物序列：CAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGA ;
[0052] 反向引物序列：AGTCTCCAACATGCCTCTCTTCATC。
[0053] 内参基因 GADPH :
[0054] 内参基因的正向引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
[0055] 内参基因的反向引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
[0056] ⑵荧光PCR扩增反应程序：
[0058] 四、标准曲线的制作：将上述测序正确的阳性克隆连入质粒，然后进行质粒浓度 测定、计算质粒拷贝数，进行10倍系列稀释，分装成IXlO6拷贝/μ1、?χ?05拷贝/μι、 IX IO4拷贝 / μ IUXlO3拷贝 / μ IUXlO2拷贝 / μ 1、IX 10 拷贝 / μ 1。
[0059] 五、结果分析：
[0060] 根据扩增曲线的Δ Δ CT值，与阴性对照相比较，来评估细胞中SOD 1的表达量。随 着细胞受氧化程度的加深，即试验中双氧水浓度的升高，Cq值下降，即SODl基因的表达量 也随之升高，与Cq值呈负相关，与表达量成正相关。因此可根据Cq值的高低来衡量SODl 的体外表达量的多少，并反应细胞受到的氧化损伤程度的大小。
[0061] 图1中可以看出5条SODl和GADPH的溶解曲线都是平滑的单峰，且基因内的重复 性非常好，证明2个基因的引物具有非常好的特异性。
[0062] 图2结果反映出SODl在不同浓度双氧水处理下，5条曲线分布的间距都比较清晰， 说明有比较好的反应灵敏性。
[0063] 从图3可以很直观的看出GADPH和SODl的条带大小均符合理论设计的片段大小， 且没有其他杂带，从肉眼宏观上证明了该基因具有非常好的准确性和特异性。
[0064] 图4中结果反应出随着细胞受氧化程度的加深，即试验中双氧水浓度的升高， SODl基因的表达量的Cq值也随之升高。因此可根据Cq值的高低来衡量SODl的体外表达 量的多少，并反应细胞受到的氧化损伤程度的大小。
[0065] 图5标准曲线。横坐标为拷贝数Ig值，众坐标为Cq值。
[0066] 本发明不局限于上述实施例，凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要 求的保护范围。
【主权项】
1. 一种锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测用引物，其特征在于： 正向引物序列为序列1，反向引物序列为序列2。2. 与权利要求1所述的锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测用引物配合使用 的内参基因GADPH引物，其特征在于： 内参基因的正向引物序列为序列3,内参基因的反向引物序列为序列4。3. -种锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测方法，其特征在于：方法如下： ⑴目标组织或细胞中总RNA的提取： ⑵采用步骤(1)提取出的RNA进行逆转录PCR，获得模板RNA; ⑶采用权利要求1所述的引物和权利要求1所述的内参基因GADPH，以及步骤(2)的模板RNA进行实时荧光定量PCR。
【专利摘要】本发明涉及一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法及所用的引物，正向引物序列见序列1，反向引物序列见序列2。本发明提供一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法，首次用qPCR的方法，以基因水平的检测来鉴定SOD1的含量，同时提供一套有针对性引物序列和内参序列，即使在样品提取的RNA中有DNA污染的情况下，也可以稳定、特异、准确的检测出人的不同组织、细胞中SOD1基因的表达量差异，且有极高的重复性，克服了市场上常用酶活检测试剂盒的人为因素影响大、稳定性差、重复性差等因素。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105177123
【申请号】
【发明人】孙麟, 马洁, 刘宇
【申请人】天津市康婷生物工程有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月19日