利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和蛋白质工程，具体是涉及一种利用pSUMO系统制备碱性成 纤维细胞生长因子的方法。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,简称FGF)是一类结构类似、 生物功能相近的肝素结合蛋白，目前共分离鉴别出23种FGFs，碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor,简称bFGF)是FGFs家族的主要成员之一，具有广泛的 生物学活性，可刺激血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖，对许多细胞有化学催化作用，诱导 内皮细胞合成胶原酶和纤溶酶原激活因子，在体内诱导血管形成，还能促进软骨、骨组织及 神经组织的损伤修复，促进肢体再生，对大脑皮层、中脑和小脑神经元均有促活作用，除用 于医疗外还被大量的运用于美容和整形，显示出广阔的应用前景。
[0003] 天然的bFGF来源于垂体等组织中，含量极少，难以大量制备。运用基因工程在大 肠杆菌中发酵生产是常用的最为经济和可持续的方法。然而在大肠杆菌中bFGF以包涵体 的形式表达，需要重折叠以恢复生物活性，而非融合的bFGF在大肠杆菌中的表达量过低。 而公开号为CN 1594565A的专利使用家蚕表达bFGF，每头家蚕产量仅600~700 μ g，且 生产周期过长；公开号为CN1345927A的专利使用酵母发酵表达bFGF，其产量低，仅20~ 100mg/L。公开号为CN 102675473A的专利融合bFGF与人胶原蛋白，其医疗方面的应用受 限制。公开号为CN103882028A的专利融合PDI辅助可溶性表达，但未提及表达量。
[0004] SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier)是一种小分子泛素样修饰蛋白，广泛存 在于各种真核细胞中，参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周 期等多种生理进程。近年来发现SUMO可作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，具有抗 蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量、促进靶蛋白正确折叠、提高可溶性等功能。目前尚 未见有利用SUMO促进bFGF高效表达的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方 法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)工程菌构建：
[0008] bFGF的原始基因序列如SEQ ID NO. 1，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2,原始基因序列 中存在Ncol酶切位点，故将其第6位的C突变成A，其氨基酸序列仍保持不变，全序列合成 优化后的基因序列如SEQ ID NO. 3。
[0009] SUMO蛋白酶ULPl在SUMO C端Gly-Gly后酶切，且经实验证明，Gly-Gly后为Met 也不影响酶切；由于不存在合适的限制性内切酶酶切位点，因此使用overlap PCR将SEQ ID NO. 3序列与SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列 内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQ ID NO. 4 ;使用Ncol和Xhol酶切拼 接序列与质粒pRSFD连接；设计引物如下：
[0010] Part A ：
[0011] 模板：pSUMO
[0012] Up primer for pSUM〇-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
[0013] bFGF Down primer for A:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
[0014] Part B:
[0015] 模板：bFGF gene
[0016] bFGF Up Primer for B:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
[0017] bFGF Down primer for B-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
[0018] 将构建好的质粒pRSFD-SUMO-bFGF转化至感受态细胞E. Coli BL21 (DE3)中；
[0019] 2)工程菌发酵：
[0020] 将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发 酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体。
[0021] 3)纯化：
[0022] 裂解菌体，离心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni胶亲和吸 附，将上清液与Ni胶混合使之结合到Ni胶上，加入SUMO蛋白酶ULPl酶切，因为SUMO与 ULPl都有His-Tag，都可以被Ni胶特异吸附而bFGF不能被吸附，所以可用砂芯漏斗将之过 滤出来；
[0023] 收集的bFGF溶液中还有少量杂质，可以使用Heparin柱亲和吸附bFGF，冲洗杂质 后，用缓冲液洗脱，纯化后的bFGF溶液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。纯化后的bFGF 纯度可以达到97%。
[0024] 在步骤2)中，所述液体培养基可采用加有Kana霉素的LB培养基。
[0025] 在步骤 3)中，所述缓冲液的配方可为：1XPBS，ImM PMSF，0. 3M NaCl，0. 1% Triton X-IOOo
[0026] 本发明应用SUMO表达系统高效稳定、可溶性地表达SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO 肽段N端前设计组氨酸标签，融合蛋白可以特异结合Ni-NTA resin，经过同样含有组氨酸 标签的SUMO蛋白酶ULPl切割后可以获得无任何氨基酸残基残留的高纯度的bFGF蛋白。经 SDS-PAGE分析，诱导表达量高达28 %，最终得到的bFGF蛋白纯度达到97 %。
【附图说明】
[0027] 图1是实施例1中载体pRSFD-SUMO-bFGF的质粒图谱。
[0028] 图2是实施例2中重组工程菌诱导表达前后的SDS-PAGE电泳图。在图2中，泳道 1为诱导前，泳道2为诱导后，泳道3为蛋白分子量Marker。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限制于这些实施 例。
[0030] 实施例1 :工程菌构建
[0031] 全序列合成SEQ ID NO. 3。bFGF的原始基因序列存在Ncol酶切位点，故将第6位 原来的C突变成A，蛋白质序列仍保持不变。
[0032] SUMO蛋白酶I在SUMO C端Gly-Gly后酶切，且经实验证明，Gly-Gly后为Met也 不影响酶切。由于不存在合适的限制性内切酶酶切位点，因此使用overlap PCR将SEQ ID NO. 1序列与SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列 内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQ ID NO. 4。使用Ncol和Xhol酶切拼 接序列及pRSFD连接。设计引物如下：
[0033] Part A ：
[0034] 模板：pSUMO
[0035] Up primer for pSUM〇-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
[0036] bFGF Down primer for A:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
[0037] Part B:
[0038] 模板：bFGF gene
[0039] bFGF Up Primer for B:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
[0040] bFGF Down primer for B-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
[0041] 构建好的质粒如图I所示，其中T7Promoter为启动子，Ncol和Xhol为酶切位点， Kan为Kana霉素抗性基因。
[0042] 按照《分子克隆实验指南》上所述的方法将构建好的质粒转化至感受态细胞 E.Coli BL21(DE3)中。
[0043] 实施例2 :工程菌发酵。
[0044] 将实施例1中构建好的工程菌涂布在加有Kana霉素的LB平板上，37°C培养箱过 夜培养，挑选单菌落接种于250ml加有Kana霉素的LB培养基中，在摇床上过夜培养，培养 条件37°C，220rpm。培养好的菌液作为菌种，接种到装有灭菌的15L LB培养基的发酵罐中， 培养至0D600 = 0. 8~1. 2时，加诱导剂IPTG诱导10h。4000g离心收集菌体。分别取诱 导前及诱导结束时的样品，进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示，其中泳道1为诱导前 样品，泳道2为诱导结束样品，泳道3为蛋白Marker。泳道2中在分子量35kd处诱导产生 的蛋白条带为SUMO-bFGF，表达量为28%。
[0045] 实施例3:蛋白纯化
[0046] 将实施例2得到的菌体混匀于5~10倍体积的裂解缓冲液中，缓冲液配方： lXPBS，lmMPMSF，(X3M NaCl，0. l%Triton X-100。超声破碎上述混合液，12000g 离心，收集 上清液。该上清液即为SUMO-FGF蛋白粗提液。将粗提液与Ni-NTA resin混合，4°C低温振 荡过夜。使SUMO-bFGF蛋白完全结合到Ni-NTA resin上。
[0047] 缓冲液冲洗SUMO-bFGF蛋白-Ni混合物。加入酶切缓冲液，适量的SUMO蛋白酶 I，低温过夜酶切。过滤酶切混合物，收集流穿液即为bFGF蛋白初制液。将上述初制液过 Heparin柱层析，用2M NaCl洗脱，收集洗脱液。洗脱液过夜透析去除NaCl，得到的即为bFGF 精制液。
[0048] 将上述bFGF精制液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。
【主权项】
1. 利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 工程菌构建： bFGF的原始基因序列如SEQIDNO. 1，氨基酸序列如SEQIDNO. 2,原始基因序列中存 在Ncol酶切位点，故将其第6位的C突变成A，其氨基酸序列仍保持不变，全序列合成优化 后的基因序列如SEQIDNO. 3 ; SUMO 蛋白酶 ULPl 在 SUMO C 端 Gly-Gly 后酶切，使用 overlap PCR 将 SEQ ID NO. 3 序 列与SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列内部并 无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQ ID NO. 4 ;使用Ncol和Xhol酶切拼接序列 与质粒pRSFD连接；设计引物如下： Part A： 模板:PSUMO UpprimerforpSUM〇-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA bFGFDownprimerforA:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC Part B: 模板：bFGF gene bFGFUpPrimerforB:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA bFGFDownprimerforB-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA 将构建好的质粒pRSFD-SUMO-bFGF转化至感受态细胞E.ColiBL21(DE3)中； 2) 工程菌发酵： 将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培 养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体； 3) 纯化： 裂解菌体，离心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni胶亲和吸附，将 上清液与Ni胶混合使之结合到Ni胶上，加入SUMO蛋白酶ULPl酶切，bFGF用砂芯漏斗过 滤；收集的bFGF溶液中还有少量杂质，使用Heparin柱亲和吸附bFGF，冲洗杂质后，用缓冲 液洗脱，纯化后的bFGF溶液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。2. 如权利要求1所述利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在 于在步骤2)中，所述液体培养基采用加有Kana霉素的LB培养基。3. 如权利要求1所述利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在 于在步骤 3)中，所述缓冲液的配方为：lXPBS，lmMPMSF，0. 3MNaCl，0. 1%TritonX-100。
【专利摘要】利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，涉及基因工程和蛋白质工程。1)工程菌构建；2)工程菌发酵：将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体。3)纯化。应用SUMO表达系统高效稳定、可溶性地表达SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO肽段N端前设计组氨酸标签，融合蛋白可以特异结合Ni-NTA？resin，经过同样含有组氨酸标签的SUMO蛋白酶ULP1切割后可以获得无任何氨基酸残基残留的高纯度的bFGF蛋白。经SDS-PAGE分析，诱导表达量高达28％，最终得到的bFGF蛋白纯度达到97％。
【IPC分类】C12P21/02, C12N1/21, C12N15/70
【公开号】CN105177033
【申请号】
【发明人】郑扶桑, 张健, 高伟, 蒋妙婷
【申请人】厦门欧瑞捷生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月23日